叶 伟 何金川 谢文霞程芳芳 杨梦瑶 马 瑶

温州医科大学附属第一医院 浙江 温州 325000

中风具有发病率高、死亡率高、致残率高的特点[1]。脑缺血再灌注损伤（CIRI）的细胞凋亡是导致神经细胞死亡的主要途径之一[2]。细胞凋亡过程中Bcl-2和Bax基因起着重要的调控作用，它们之间的平衡决定了凋亡诱导[3]，Bcl-2为STAT3的下游靶因子，STAT3通过调节下游靶蛋白的表达从而在抗凋亡方面发挥作用。笔者在先前的研究中发现电针“百会”“内关”可以迅速激活脑内JAK2/STAT3信号通路，减少脑梗死体积，改善CIRI后小鼠的神经功能[4]。随后亦对Bcl-2及Bax表达影响作了进一步研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组：SPF级C57BL/6N小鼠60只，体质量18～20g，年龄6～8周。饲养于温州医科大学附属第一医院动物实验中心。饲养环境：温度23～25℃，湿度60%～80%，人工光照12h：12h明暗交替。予以自由饮食与饮水。实验过程中对动物的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。小鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法将所有小鼠分成3组：假手术组、对照组、电针组，每组20只。各组再分2h、8h、24h、7d四个亚组，每亚组各5只。

1.2 主要试剂和仪器：麻醉剂水合氯醛；2，3，5－三苯基氯化四氮唑、4%多聚甲醛溶液购自Solarbio公司；Bcl-2、Bax、P-JAK2、P-STAT3、β-actin-抗和碱性磷酸酶标记山羊抗兔均购自美国CST公司。电泳槽、转膜仪均购自美国Bio-rad；37℃恒温箱；超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；华佗牌SDZ-ⅡB电针仪电子针疗仪；佳辰牌针灸针具（江苏省吴江市佳辰针灸器械有限公司）。

1.3 小鼠MCAO模型制作：术前动物禁食24h，自由饮水。采用改良的Longa法制备MCAO小鼠模型，在1.5h后，拔出线栓，使动脉血流再灌注。整个实验过程中注意小鼠保暖。小鼠苏醒后，采用Longa的5分制法进行评定，1～3分为动物缺血模型建立成功的标志。没有神经病理症状或者神经病理症状不明显的予以去除，用同一批次组别的小鼠制成合格模型后凑足数目。

1.4 干预方法：假手术组：小鼠接受相同的麻醉操作与模型组一样的各项手术操作，但只进行动脉分离的操作，不插入线栓，不给予电针干预。模型组：采用改良Longa线栓法制备，缺血1.5h后拔出线栓，模型建立后不进行任何干预处理，不给予电针干预。电针组：建立模型，缺血1.5h后拔出线栓再灌注。造模成功后将小鼠固定在筒形小鼠固定器上，暴露小鼠前肢、头部，参照郭义主编《实验针灸学》的择穴方法取“百会”“内关”（患侧）。使用0.16mm×13mm毫针，“百会”穴沿皮平刺2mm，“内关”穴直刺0.3mm。选用SDZ-ⅡB型华佗牌电针仪进行电刺激，疏密波，频率2/15hz，强度1mA，以小鼠安静且穴周组织轻微抖动为度。第一次电针在小鼠造模后1小时立即开始，以后每天1次，每次30min，直到处死小鼠的那一天。

1.5 检测指标及方法：Bcl-2、Bax蛋白表达含量测定（Western Blot）：于再灌注后2h、8h、24h、7d各相应时间点，分别取5只小鼠麻醉后，迅速处死，电针组和模型组取缺血侧半暗带，假手术组取同侧皮质。各组取适量组织加入组织裂解液混合物，冰上采用超声波（80W）粉碎组织，随后离心取上清液，用BCA法测量蛋白含量，样品变性后行10%SDS-PAGE凝胶电泳，操作完毕后马上进行转膜，然后用3%BSA封闭1小时，封闭后切下P-JAK2蛋白、P-STAT3蛋白、BCL-2蛋白、BAX蛋白、β-actin对应条带，对应一抗孵育过夜，TBST清洗加室温二抗孵育，TBST清洗。将膜用ECL发光显色液曝光，拍照保存。用Image J测量各条带灰度值，并将目标蛋白灰值和内参灰度值的比值作为其相对表达量，进行各组的对比。

1.6 统计学分析：采用SPSS 25.0软件包对数据进行处理、分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，二分类资料采用最小显著差值法（LSD）比较，多分类资料采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

各组MCAO小鼠缺血灶半暗带区Bcl-2/Bax比值比较如图1所示。假手术组的Bcl-2/Bax比值，7天内表达平稳，组内比较无统计学意义（P＞0.O5）；与其他两组对比，在各个时间点相比偏低（P＜0.O1）。模型组、电针组的变化趋势相同：在I/R后2h开始升高，I/R后8h达高峰（P＜0.O1），随后下降；在I/R后7d比值最低（P＜0.O1）；电针组与模型组组间比较，I/R后8h、24h Bcl-2/Bax比值电针组均高于模型组（P＜0.O1、P＜0.O5）；I/R后7d低于模型组（P＜0.O5）。

图1 各组MCAO小鼠缺血灶半暗带Bcl-2/Bax比较图

3 讨论

电针治疗缺血性中风是临床上行之有效的方法之一[5]，许多研究发现缺血前给予单次或多次的电针治疗，可以诱导脑缺血耐受，降低缺血后再灌注损伤的程度，改善各种功能障碍，起到预防及治疗脑神经损伤的作用。百会穴是手足阳经、督脉等多经交会的部位，全身经脉之气汇聚之所，为古今医家治疗脑病之要穴；内关为手厥阴心经的络穴，又是八脉交会穴之一，通于阴维脉，具有宁心定智、宽胸理气、活血通络止痛之功效，是针灸防治心脑疾病的首选穴。百会穴、内关穴配合被广泛用于治疗中风等临床疾病。

有研究发现[6]脑缺血再灌注可诱发细胞凋亡，大鼠全脑I/R后，缺血2h再灌注0.5h，缺血区有较多的凋亡细胞；再灌注12h，凋亡细胞数量达高峰。因此我们选择小鼠造模后1小时立即进行电针干预，并在前期实验[4]中于I/R后不同时间点动态观察I/R后梗死体积、PJAK2和P-STAT3表达变化规律，发现电针组的P-JAK2、P-STAT3水平于I/R后2h迅速升高，在I/R后8h、24h远远高于模型组与假手术组；同时，I/R后24h、7d各相应时间点，电针组梗死体积明显小于模型组与对照组，证实电针组的细胞凋亡程度低于模型组。

Bcl-2和Bax是一对功能上相对的凋亡调控基因，Bcl-2是抗凋亡基因，可阻止许多因素所诱导的细胞凋亡，而Bax是促凋亡基因，Bax蛋白不但拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且有直接促进细胞凋亡的功能；它们是JAK2/STAT3信号通路的下游靶因子，在抗凋亡、减轻炎症反应等方面发挥作用。本次实验中，I/R后，电针组小鼠脑组织半暗带区Bcl-2表达减弱，但Bax的表达更少，因此Bcl-2/Bax比值反而逐步上升，到24 h达到高峰，且每个时间段的比值高于模型组。推测电针虽然抑制了Bcl-2，但同时更强烈抑制Bax的表达，使Bcl-2/Bax比值上升达到抗凋亡作用；因此在I/R后24h、7d，电针组梗死体积明显小于模型组，提示电针有提高Bcl-2/Bax比值达到减轻CIRI的作用。结合前期的实验结果，推测电针可迅速加快JAK/STAT信号通路活化，促进半暗带中P-JAK2和P-STAT3的表达，增加Bcl-2/Bax比值，参与细胞抗凋亡及免疫调节等过程，这可能是针刺干预CIRI的部分作用机制。