吴黎艳 陆增生 何蓓晖 陈永灿 陈芝芸#

1 浙江省立同德医院 浙江 杭州 300012

2 浙江中医药大学附属第一医院 浙江 杭州 310006

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）具有广泛的疾病谱，其中包括单纯性非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纤维化、肝硬化，甚至疾病终末期的肝细胞肝癌[1]。近年的研究显示，高脂饮食、肥胖等因素引发的脂质代谢紊乱所产生的脂毒性，导致肝脏内质网应激在NASH的发生进展中扮演着重要作用。本研究从内质网应激角度来研究益气补肾调脂方改善高脂高果糖饮食诱导的NASH小鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物：30只C57BL/6小鼠，雄性，SPF级，体重约20±2克，由上海西普尔-必凯实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2013-0016；饲养于浙江中医药大学实验动物中心。

1.2 益气补肾调脂方浸润膏的制备：黄芪、炒白术、茯苓、制首乌、淫羊藿、郁金、生山楂、海藻、桃仁，中药复方按10∶4∶5∶3∶4∶3∶8∶3∶3比例组成，由浙江中医药大学附属第一医院中药制剂室制成流浸膏。

1.3 主要实验仪器和试剂：ABI7900PCR仪（美国ABI公司），OSE-Y10电动研磨器（TIANGEN公司），JA1003N型天平（梅托勒-托利多仪器有限公司），恒温孵育摇床（美国Eppendorf公司），游离脂肪酸（FFAs）试剂盒（ELISA）由abcam公司提供（批号：ab65342），基因引物由上海生工生物技术（Sangon Biotech）公司设计，并由上海生工生物技术（Sangon Biotech）公司合成，见表1。

表1 内质网应激相关基因mRNA的引物序列

1.4 实验方法：30只小鼠适应性饲养1周后，随机分为5组，正常组、模型组、益气补肾调脂方高剂量组、益气补肾调脂方中剂量组、益气补肾调脂方低剂量组，每组各6只。正常组予标准饲料喂养以及自由饮水，其他各组予高脂饲料喂养以及自由饮用20%果糖水，在造模第5周开始，益气补肾调脂方高、中、低剂量组分别灌服53.52g/（kg·d）、26.76g/（kg·d）、13.38g/（kg·d）益气补肾调脂方流浸膏，连续给药12周，正常组和模型组灌服等容量蒸馏水；16周末处死所有小鼠；腹腔麻醉下取血和收集肝脏标本，ELISA法检测血清游离脂肪酸(FFAs)水平；real time-PCR法检测相关基因mRNA，以β-actin为内参照基因,计算目标基因的相对表达量(2-△△Ct)。

1.5 统计学方法：所有数据运用SPSS 17.0软件进行分析，数据结果以均数±标准差表示，采用单因素方差分析，多组间比较用LSD分析(方差齐性时)或Dunnett’s T3(方差不齐性时)。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 益气补肾调脂方对NASH小鼠血清FFAs的影响：高脂高果糖饮食喂养16周时，模型组和各中药复方组的血清FFAs水平较正常组具有不同程度的升高（P＜0.05，P＜0.01）。经不同剂量的益气补肾调脂方干预后，小鼠血清FFAs水平较模型组具有不同程度的下降。见图1。

图1 益气补肾调脂方对NASH小鼠血清FFAs的影响(n=6)

2.2 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝脏内质网应激相关基因mRNA的影响：经过16周高脂高果糖饮食后，模型组肝组织葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、激活转录因子6（ATF6）、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）mRNA的表达水平较正常组明显升高，经过不同剂量的益气补肾调脂方干预后，肝组织GRP78、ATF6、CHOPmRNA的表达水平较模型组均有不同程度的下降（P＜0.05）。模型组肝组织XBP1mRNA的表达水平较正常组下降（P＜0.05），经过不同剂量的中药复方干预后，各治疗组的肝组织X-盒结合蛋白1（XBP1）mRNA较模型组均有所上升（P＜0.05）。见图2。

图2 益气补肾调脂方对NASH小鼠肝脏内质网应激相关mRNA的影响(n=6)

3 讨论

内质网应激（ERS）在NASH的发病机制中具有重要作用[2-4]。高脂或高脂高糖等情况下，机体内大量的FFAs等产生的脂毒性所引发的ERS，会激发一系列的促凋亡通路，进而导致肝细胞的损伤、凋亡[5]。GRP78是ERS的标志物[6]。ERS介导ATF6/CHOP信号通路的激活，并抑制XBP1的表达[7]，参与NASH的发生进展。本研究发现，经高脂高果糖饮食诱导的NASH小鼠，血清中FFAs明显升高，ERS的标志物GRP78mRNA的表达明显升高，同时，ATF6、CHOPmRNA的表达也增强，XBP1mRNA的表达受到抑制。提示血清FFAs升高等产生的脂毒性所引发的ERS，激发ATF6/CHOP信号通路，促使NASH的发生进展。

NASH可归属于中医学中“肝着”“积聚”“痞满”等范围。其发病多由于肝、脾、肾功能失调，湿、痰、瘀互结而致。益气补肾调脂方中炙黄芪补脾肺之气，炒白术健脾助运，茯苓健脾利水渗湿；制首乌、淫羊藿补肝肾、益精血；海藻消痰软坚散结，生山楂祛瘀消积，桃仁破血逐瘀，郁金行气解郁、活血化瘀，以助痰瘀消除。诸药合用，使湿、痰、瘀、积得消，共达益气健脾、补肾益肝、化痰祛瘀之功。前期研究显示，益气补肾调脂方能够明显改善NASH小鼠肝脏病理组织学变化，提高机体的抗氧化能力[8]。本研究显示，高脂高果糖饮食诱导的NASH小鼠，经益气补肾调脂肪干预后，能够明显下降肝组织内质网应激标志物GRP78mRNA的表达，下降ATF6、CHOPmRNA的表达，并能在一定程度上提升XBP1mRNA的表达。因此，益气补肾调脂方治疗NASH的作用机制可能与改善肝脏的内质网应激有关。