於鹏飞 柴佳园 李俊峰 王康 刘文洪

结核病作为由结核分枝杆菌感染导致的传染性疾病，对人类的生命健康造成了巨大威胁[1]，目前中国结核病防治形势同样严峻[2]。异烟肼和利福平是治疗结核病的一线药物，两者联用效果更佳，但两者联用会导致肝损伤[3-4]。因此，急需寻求一种药物在治疗肺结核的同时能有效降低异烟阱和利福平一线抗结核药物导致的肝损伤。青藤碱提取自中药青藤，具有镇痛、镇静、免疫抗炎等功能。研究表明，青藤碱能对人体肝脏星状细胞的增殖和凋亡产生调控作用[5]，能够治疗刀豆蛋白A（concanavalin A，Con A）导致的免疫性肝损伤[6]等。本研究探讨青藤碱对异烟肼和利福平联用致小鼠肝脏损伤的保护作用，从而为开发和寻找保护肝损伤药物提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物 3～8周雄性清洁级ICR小鼠60只，体重18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SYXK（浙江）2015-0009，由浙江中医药大学动物实验研究中心喂养。动物房环境：温度（23±3）℃，湿度50%～70%，12 h昼夜循环。小鼠自由饮水及进食。

1.2 药品、试剂与仪器 青藤碱 [CAS号：115-53-7，纯度：高效液相色谱（HPLC）≥98%，批号：Dasf200329]购自南京道斯夫生物科技有限公司；异烟肼（规格：100 mg，批号：T20C081）购自杭州民生药业有限公司；利福平（规格：0.15 g，批号：1908021）购自沈阳红旗制药有限公司；联苯双酯（规格：1.5 mg，批号：A02J191005）购自万邦德制药集团股份有限公司；AST试剂盒（批号：20200713）、ALT 试剂盒（批号：20200712）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒（批号：20200715）、TG 试剂盒（批：20200712）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）试剂盒（批号：20200710）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（批号：20200713）、考马斯蓝蛋白试剂盒（批号：20200712）均购自南京建成生物工程研究所；高速离心机（型号：FC5718）购自上海安亭仪器有限公司；电子天平（型号：JA2003N）购自上海菁华科技仪器有限公司；光学显微镜（型号：DM300）、石蜡切片机（型号：RM2265）均购自德国徕卡公司。

1.3 分组造模和给药 采用随机数字表法将60只小鼠分为正常对照组、模型组、青藤碱低剂量组、青藤碱中剂量组、青藤碱高剂量组和联苯双酯组6组，每组10只。除正常对照组外，其余各组给予异烟肼（100 mg/kg，溶于20 ml 0.9%氯化钠注射液）和利福平（100 mg/kg，溶于20 ml 0.9%氯化钠注射液）灌胃建立肝损伤小鼠病理模型[7]；正常对照组给予20 ml 0.9%氯化钠注射液灌胃。造模2 h后，正常对照组和模型组分别给予蒸馏水（20 ml/kg）灌胃，青藤碱低、中、高剂量组分别给予青藤碱 50、100、150 mg/kg（均溶于 4 ml蒸馏水）灌胃，联苯双酯组给予联苯双酯（200 mg/kg，溶于4 ml蒸馏水）灌胃，各组均连续给药，1次/d，连续10 d。

1.4 检测材料收集与处理 所有动物末次灌胃后禁水禁食24 h，称体质量。压迫小鼠颈部两侧，使眶后静脉丛充血，持玻璃毛细血管从小鼠左侧内眦部刺入取血。脊椎脱臼法处死，开腹、取肝脏，清洗干净、擦干、称肝质量。肝脏指数=肝质量（mg）/体质量（g）。切大约 0.5 g肝右叶制备肝匀浆，在0.9%氯化钠溶液中漂洗干净，剥除表面附着的结缔组织并用滤纸拭干，用移液管量取9倍于肝脏体积的0.9%氯化钠溶液预冷，在冰水浴中用眼科小剪尽快剪碎组织块并利用组织匀浆机匀浆，3 000 rpm离心10 min，取上清液，待测。

1.5 生化指标检测 采用比色法测定血清ALT、AST、TG水平以及肝匀浆中MDA含量、SOD活性及GSH含量。严格遵照产品说明书进行测定。

1.6 肝组织形态学变化观察 从肝左外叶中取材，10%甲醛固定后，经梯度乙醇脱水，二甲苯处理后，常规石蜡包埋、切片、HE染色，光学显微镜观察肝组织形态学变化。

1.7 统计学处理 采用SPSS 25.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，方差齐时，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；方差不齐时，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Mann-Whitney U检验。偏态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Mann-Whitney U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠肝脏指数比较 与模型组比较，青藤碱中、高剂量组和联苯双酯组肝脏指数均下降（均P＜0.05），见表1。

表1 各组小鼠肝脏指数比较

2.2 各组小鼠血清ALT、AST、TG水平比较 与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT和AST水平均升高（均P＜0.01）。与模型组比较，青藤碱高剂量组和联苯双酯组小鼠血清 ALT、AST、TG 水平均降低（均 P＜0.05），青藤碱中剂量组小鼠血清AST、TG水平均降低（均P＜0.05），见表 2。

表2 各组小鼠血清ALT、AST、TG水平比较

2.3 各组小鼠肝匀浆SOD活性及GSH、MDA水平比较与正常对照组比较，模型组小鼠肝匀浆中SOD水平降低（P＜0.01）。与模型组比较，青藤碱高剂量组小鼠肝匀浆中SOD活性升高（P＜0.01）；青藤碱中、高剂量组小鼠肝匀浆中GSH水平均升高（均P＜0.01）；青藤碱低、中、高各剂量组小鼠肝匀浆中MDA水平均降低（均P＜0.01），见表 3。

表3 各组小鼠肝匀浆SOD活性及GSH、MDA水平比较

2.4 各组小鼠肝脏组织形态学变化比较 肉眼观察：正常对照组小鼠肝颜色为红褐色，大小形态正常，质地柔软、光滑；模型组小鼠肝损伤体积变大，色泽暗黄，肝缘圆钝；青藤碱各剂量组和联苯双酯组小鼠肝有轻微的水肿表现，质地柔软，色泽红褐。光镜下观察：正常对照组小鼠肝细胞形态正常，肝索排列规则，肝小叶结构完整，界限清晰，以中央静脉为中心，肝脏细胞排列呈放射状，肝细胞核大且圆，分布均匀；模型组小鼠肝组织损伤严重，肝索排列紊乱，肝小叶结构不清，界限模糊，肝组织炎性细胞浸润；青藤碱各剂量组肝小叶结构接近正常，肝细胞排列较为整齐，炎性细胞浸润减少，肝损伤程度随着青藤碱剂量的增加而减轻，较模型组有所改善；联苯双酯组小鼠可见肝细胞轻度破坏，较模型组肝小叶结构和细胞形态得到改善，炎症细胞量有所下降（图1，见插页）。

图1 各组小鼠肝脏组织形态学观察所见（a：正常对照组；b：模型组；c：联苯双酯组；d：青藤碱低剂量组；e：青藤碱中剂量组；f：青藤碱高剂量组；HE染色，×200）

3 讨论

近年来关于青藤碱的研究表明其在肝损伤领域具有一定的治疗效果。朱昱豪等[8]研究发现青藤碱能够减弱Con A导致的免疫性肝损伤，减轻肝脏受损状况并且降低血清中ALT、AST水平。郭华等[9]研究发现青藤碱能减轻氧化应激反应并且对炎症反应具有疗效。尹晓刚等[10]研究发现青藤碱具有抑制大鼠过氧化物和抗脂质过氧化的作用。因此，本实验选择青藤碱作为一种可能的肝损伤治疗药物进行研究。

长期大量使用异烟肼和利福平治疗结核病会导致严重的药物不良反应，尤其会引起使用者药物性肝脏损伤[11-12]。韩悦等[13]利用HE染色研究异烟肼与利福平联用之后肝组织形态，发现药物性肝损伤后肝细胞病变显著，随着抗损伤药物使用剂量的增加，这种损伤明显减轻，同时肝脏指数也得到改善。本研究显示，模型组小鼠肝组织中有大量炎性细胞，随着青藤碱剂量的增加，肝脏细胞的病变逐渐减轻，炎症反应得到缓解，同时青藤碱能够使小鼠肝脏指数下降。王翠荣等[14]研究发现异烟肼与利福平联用会导致肝脏损伤小鼠上层血清液中ALT、AST水平升高，而ALT与AST是检验肝脏组织损害常用的指标。本研究结果显示，模型组小鼠ALT及AST水平较高，青藤碱给药后ALT及AST水平降低，同时随剂量增加而降低。王翠荣等[14]研究还发现肝受损小鼠肝脏匀浆SOD与谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平降低，MDA水平升高。金华等[15]研究发现肝脏急性受损小鼠可能与其体内氧自由基作用和肝组织细胞膜脂质过度氧化反应被抑制有关。MDA水平可以提示肝细胞脂质过度氧化度，GSH与氧自由基清除有关。本研究结果显示，青藤碱给药后肝匀浆中SOD活性与GSH水平升高，MDA水平降低，可能与青藤碱能够使氧自由基减少与抑制脂质过氧化有关。

综上所述，青藤碱能够保护异烟肼和利福平联用而导致的小鼠肝损伤，但青藤碱对慢性药物性肝炎的具体作用机制仍需进一步研究。