王成 曹孝荣 黄哲璟 王扬剑

肌腱损伤包括各种急性损伤和慢性退行性改变[1-2]，损伤后的自然愈合是一个缓慢的过程，组织常发生纤维化，导致肢体功能受限，因此常需要手术干预和康复治疗[3-4]。然而，术后肌腱由于胶原纤维的无序沉积以及瘢痕组织的形成，可导致肌腱生物力学性能丧失[3-4]。另外，肌腱漫长的重塑过程可致肌腱粘连或关节挛缩[5-6]，发生再损伤的概率也很高。因此，迫切需要提高受损肌腱的愈合效率及质量[3，5-6]，基于细胞的肌腱组织工程有望解决这一问题。肌腱来源的肌腱干细胞（tendon derived stem cells，TDSC）具有多向分化的能力，在维持肌腱稳态和损伤后修复中发挥关键作用，被认为是肌腱愈合较好的细胞来源之一[7-9]。在应用外源性TDSC促进肌腱愈合的研究中发现，TDSC注入体内后需要经历存活、活化、增殖和分化等过程，合适的生长因子可促进TDSC增殖和向成纤维细胞分化[9-10]。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一种多能细胞生长因子，可促进多种损伤后修复。研究发现，bFGF不仅能促进骨髓间充质干细胞的增殖、自我更新和分化，而且可刺激肌腱Ⅰ型和Ⅲ型胶原的合成，有利于新生肌腱获得更好的生物力学性能[11-12]。然而以上结论是基于间充质干细胞的研究，bFGF对TDSC的作用和机制尚不明确。近年来，研究发现TDSC的生成与miRNA的差异表达相关[13]。有研究报道bFGF诱导的血管重塑通路主要调节miR-222[14]，在增生期，新血管形成是肌腱愈合的重要组成部分[15-16]。因此，本研究进一步探讨bFGF对大鼠TDSC增殖的影响，并探索bFGF是否能通过影响miR-222的差异表达来发挥肌腱损伤修复的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 成年（8～12周龄）SD大鼠10只。大鼠自由获取食物和水，饲养在一个12 h光-暗循环的房间。所有动物在实验前均经过1周适应。本实验经宁波大学医学院动物实验中心审批通过。

1.2 试剂和仪器 大鼠TDSC完全培养基（批号：CMR165）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；FBS、胰酶、青霉素-链霉素溶液、PE-CD44抗体（批号：12-0441-82）、FITC-CD14 抗体（批号：11-0141-82）、转染试剂Lipofectamine RNAiMAX均购自美国ThermoFisher Scientific公司。PE 标记抗小鼠 IgG1（批号：553873）、FITC标记抗小鼠IgG1（批号：562001）阴性对照抗体均购自美国BD公司；地塞米松（批号：D829854）、维生素C（批号：A800295）、β-甘油磷酸钠（批号：G806967）、谷氨酰胺（批号：L810391）、胰岛素（批号：I828365）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，批号：I811775）、吲哚美辛（批号：I811784）均购自麦克林试剂有限公司；NovoScript 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（gDNA Purge）试剂盒及NovoStarSYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒均购自上海Novoprotein公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0012S）、bFGF 大鼠重组蛋白（批号：P6348）、CCK-8试剂盒（批号：C0037）、油红O 染色试剂盒（批号：C0157S）、成骨细胞矿化结节染色试剂盒（茜素红S法，批号：C0148S）及阿尔新蓝-核固红染色试剂盒（批号：C0155M）均购自碧云天生物科技有限公司；miR-222抑制剂miR-222 in由上海吉玛公司合成；Attune NxT流式细胞仪、酶标仪（Multiskan-FC）均购自美国ThermoFisher Scientific公司；7500F实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；免疫印迹成像系统购自美国UVP公司。

1.3 大鼠TDSC的原代细胞培养 采用植块法进行原代细胞培养，成年大鼠脊椎脱臼法处死后迅速浸入75%乙醇溶液中，取大鼠后足部位肌腱组织，肌腱均匀剪碎成1 mm3大小，用少量培养基重悬组织块，置于培养皿中，置于37℃含有5% CO2的培养箱中培养，待10 d左右大量肌腱细胞游离出来以后，使用含3% FBS的大鼠TDSC完全培养基进行培养。每3～4 d换液1次，细胞的P1～P3代用于后续的实验。

1.4 TDSC中CD44+且CD14-细胞比例检测 采用流式细胞术。将5×105个P3代TDSC用300 μl 1×结合缓冲液重悬，加入PE-CD44和FITC-CD14抗体，并设置同型对照管，室温孵育45 min，PBS洗1次，12 000 g离心5 min，去上清液，500 μl结合缓冲液重悬后上流式细胞仪分析。

1.5 多向分化能力检测 将P3代TDSC悬液以5×103个/cm2细胞浓度接种至6孔培养板中，至细胞完全融合，在TDSC完全培养基基础上分别加不同诱导液，包括成脂肪诱导液（含10 mM 胰岛素、500 μmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、400 mmol/L吲哚美辛），成骨诱导液（含1 nmol/L地塞米松、50 mmol/L维生素C、20mmol/L β-甘油磷酸钠）和成软骨诱导液（含0.5 μmol/L地塞米松、100 mg/L维生素C、10%胰岛素-转铁蛋白-硒、50 mg/L脯氨酸、100 mg/ml丙酮酸）。同时取完全培养基作为对照组，每3 d换液1次。28 d后采用Western blot法分别检测成脂肪细胞标志蛋白[过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPAR-γ2）、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）和脂肪酶（Adipsin）]、成骨细胞标志蛋白[骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙素（osteocalcin，OC）和 ALP蛋白]和成软骨细胞标志蛋白[聚集蛋白聚糖（aggrecan，Agg）、X型胶原蛋白（collagen type X，CollX）、Ⅱ型胶原蛋白（collagen type Ⅱ，Coll Ⅱ）]。同时对成脂细胞进行油红O染色（具体方法参照碧云天油红O染色试剂盒说明书），成骨细胞进行茜素红S染色（具体方法参照碧云天成骨细胞矿化结节染色试剂盒说明书），成软骨细胞进行阿尔新蓝法染色（具体方法参见碧云天阿尔新蓝-核固红染色试剂盒说明书）。

1.6 蛋白表达水平检测 采用Western blot法。培养皿放于冰上，弃去培养基，预冷PBS漂洗细胞2次，加入RIPA裂解液，冰上裂解细胞5 min，收集细胞裂解物，1 ml注射器吹打以破坏DNA。取3 μl进行BCA蛋白定量，剩余样本加入上样缓冲液后95℃下孵育10 min，储存于-20℃备用。制备10% SDS-PAGE凝胶，每孔加入40 μg蛋白，电泳分离蛋白质后，恒定电流将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h。加入一抗，4℃孵育过夜，加入内参抗体β-actin并在室温下孵育1 h后，用TBST洗膜3次。加入二抗，室温孵育2 h，用TBST洗膜3次。加入ECL发光溶液，并在UVP化学发光凝胶成像系统中显影，蛋白条带通过Image J软件进行灰度值量化。

1.7 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。细胞消化后计数，以每孔5 000个细胞接种于96孔板中，24 h后加入终浓度为 1、10、100、1 000、10 000 μg/L 的 bFGF，每组3个复孔，设置不加bFGF的TDSC为对照孔。置于37℃恒温培养箱中培养48 h，加入20 μl CCK-8溶液，37℃培养箱孵育4 h后，酶标仪检测450 nm处吸光度（OD）值，计算细胞增殖率。细胞生长曲线，在TDSC中加入1 000 μg/L bFGF（bFGF组）后，以不做任何处理的TDSC作为对照组，分别于第1、3、5、7天进行细胞计数。

1.8 细胞克隆形成能力检测 采用平板克隆形成法。细胞接种密度为500个细胞/cm2，对照组在完全培养基中培养，bFGF组用含1 000 μg/L bFGF的培养基培养，连续培养10 d后结晶紫染色，50个细胞以上为1个克隆，计数克隆数。

1.9 细胞转染 取对数生长期且生长状态良好的正常TDSC，按5×105细胞/孔接种在6孔板中，分为TDSC组、TDSC+bFGF组、TDSC+miR-222 in组和 TDSC+bFGF+miR-222 in组4组。TDSC组（空白对照）在完全培养基中培养；TDSC+bFGF组在含有1 000 μg/L bFGF的培养基中培养；TDSC+miR-222 in组转染miR-222 in后在完全培养基中培养；TDSC+bFGF+miR-222 in组转染miR-222 in后在含有1 000 μg/L bFGF的培养基中培养，每组设置3个复孔。使用Lipofectamin RNAiMAX进行转染。第1、3、5、7天取出培养箱中的细胞，CCK-8法检测细胞增殖能力（参照方法1.7），绘制细胞生长曲线。

1.10 miR-222表达水平检测 采用qPCR法。用不同浓度 bFGF（0、100、500、1 000 μg/L）处理 TDSC 24 h，收集细胞，Trizol法提取细胞RNA后，使用NovoScript1st Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒将RNA逆转录为cDNA后，按照NovoStartSYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒操作说明书检测miR-222表达水平。以U6为内参，用2-ΔΔCt计算miR-222的相对表达量，每个样品进行3次重复测试。使用的引物如下：miR-222正向引物：5'-GCTCAGTAGCCAGTGTAG-3'，反向引物：5'-GAACAT GTCTGCGTATCTC-3'；U6 正向引物：5'-TGGAACGCT TCACGAATTTGCG-3'，反向引物：5'-GGAACGATACAGAGAAGATTAGC-3'。TDSC细胞转染miR-222 in后的miR-222表达水平也依照上述方法进行检测。

1.11 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。所有实验均单独重复3次。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠TDSC的建立和鉴定 应用植块法在第3～4天即可看到有细胞从组织块周围生长出来；细胞培养第7天，即可在镜下观察到呈集落样生长的TDSC，部分细胞细长，呈纤维状；随后在第20天细胞增殖进入平台期（图1a-c）。流式细胞术检测TDSC中CD44+且CD14-细胞比例为91.83%（图1d）。对TDSC进行成脂肪细胞诱导，结果显示油红O染色后有大量的油脂（红色部位）生成（图2a，见插页）；对TDSC进行成骨细胞诱导，结果显示茜素红S染色后有大量的钙沉积（橙色部位）（图2b，见插页）；对TDSC进行成软骨细胞诱导，结果显示阿尔新蓝染色后有大量的软骨细胞阳性显色（蓝色部位）（图2c，见插页）。分别对对诱导后成脂肪细胞的标志蛋白（PPAR-γ2、LPL、Adipsin）、成骨细胞标志蛋白（OPN、OC、ALP）及成软骨细胞标志蛋白（Agg、Coll X、Coll Ⅱ）进行检测，不同类型细胞标志性蛋白均呈阳性表达，提示诱导分化成功（图2d-f，见插页）。

图1 大鼠肌腱干细胞（TDSC）原代培养建立以及细胞纯度分析（a-c：TDSC培养中细胞形态；d：流式细胞分析TDSC中CD44+且CD14-细胞比例）

图2 大鼠肌腱干细胞（TDSC）诱导分化为成脂肪、成骨和成软骨细胞的能力[a：诱导成脂肪细胞后，油红O染色确定细胞脂肪滴水平，×200；b：诱导成骨细胞后，茜素红S染色确定细胞钙沉积水平，×200；c：诱导成软骨细胞后，阿利新蓝染色检测软骨诱导效果，×200；d：成脂肪细胞相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ2（PPAR-γ2）、脂蛋白脂肪酶（LPL）和脂肪酶（Adipsin）表达的凝胶成像图；e：成骨细胞相关蛋白骨桥蛋白（OPN）、骨钙素（OC）和ALP蛋白表达的凝胶成像图；f：成软骨细胞相关蛋白聚集蛋白聚糖（Agg）、Ⅹ型胶原蛋白（CollⅩ）、Ⅱ型胶原蛋白（Coll Ⅱ）表达的凝胶成像图]

2.2 bFGF对大鼠TDSC增殖和克隆形成能力的影响bFGF可以刺激TDSC的增殖，当1 000 μg/L bFGF作用于TDSC时，细胞增殖率达到最高，为160%，见图3a。bFGF可明显促进细胞增殖，第7天时细胞增殖水平达到最大，OD值为0.635±0.036，高于对照组的0.420±0.026，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3b。bFGF 可促进TDSC克隆形成，作用10 d后bFGF组形成更多的克隆（图 3c）。bFGF 组克隆数为（75±4）个，多于对照组的（50±5）个，差异有统计学意义（P＜0.05），见图 3d。

图3 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对大鼠肌腱干细胞（TDSC）增殖和克隆形成能力的影响（a：不同浓度bFGF作用于TDSC后细胞增殖率比较；b：1 000 μg/L bFGF作用于TDSC后对细胞生长曲线的影响，与对照组比较，*P＜0.05；c：作用10 d后，bFGF对TDSC克隆形成能力的影响；d：bFGF组和对照组细胞克隆数比较，与对照组比较，*P＜0.05；OD为吸光度）

2.3 bFGF对miR-222过表达或抑制的TDSC的增殖能力和miR-222表达的影响 随着bFGF浓度的增加，TDSC 中 miR-222相对表达量增加（P＜0.05）；与 0 μg/L比较，500、1 000 μg/L bFGF 处理后 TDSC 中 miR-222相对表达量均增加（均P＜0.05），见图4a。miR-222 in可明显降低TDSC中miR-222相对表达量（P＜0.05），见图4b。与TDSC组比较，TDSC+miR-222 in组细胞增殖变慢，而TDSC+bFGF+miR-222 in组在加入bFGF后则可以恢复miR-222 in对细胞的抑制效应，见图4c。

图4 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对miR-222过表达或抑制的大鼠肌腱干细胞（TDSC）的增殖能力和miR-222表达的影响（a：不同浓度bFGF处理的TDSC中miR-222相对表达量比较，与0 μg/L比较，*P＜0.05；b：转染miR-222 in后，qPCR检测TDSC中miR-222相对表达量，与TDSC比较，*P＜0.05；c：加入bFGF和miR-222 in后对TDSC生长曲线的影响；OD为吸光度）

3 讨论

TDSC是一种多能干细胞，在维持肌腱稳态和恢复中发挥重要作用[17]。由于TDSC是肌腱组织的来源，因此特别适用于肌腱和肌腱-骨交界处的修复。此外，与其他组织分离的非造血成体干细胞相比，它们还具有更高的产量、集落形成能力、增殖能力和多向分化潜能。本研究中，使用地塞米松、维生素C等化合物诱导大鼠TDSC，诱导后可分别得到成脂肪、成骨、成软骨细胞，说明大鼠TDSC具有较好的多向分化潜能。TDSC作为肌腱组织的固有细胞，可更好地适应肌腱微环境，并优先分化为肌腱细胞[18]。Guo等[17]发现，与骨髓来源的间充质干细胞相比，TDSC可能有更好的肌腱组织特异性和分化特性。Chen等[19]研究结果表明，将新型壳聚糖支架植入TDSC可以加速肌腱愈合，为肌腱再生提供了一种基于干细胞的新策略。

近年来，研究人员尝试将生长因子、细胞疗法与传统医疗手段相结合来实现无瘢痕肌腱组织再生，拟解决成人肌腱在损伤后不能自我再生的问题。如利用生长分化因子5可促进肌腱干细胞的肌腱分化，转化生长因子-β1和胰岛素样生长因子-1可增加TDSC的增殖并有利于表型维持。bFGF在损伤肌腱处初始愈合过程中升高，这预示着bFGF可能在肌腱愈合的早期发挥重要作用[20]。本研究发现，bFGF可以刺激TDSC的增殖，与未加bFGF的TDSC相比，最高可达到160%的增殖率。同时bFGF也促进了TDSC的克隆形成能力，克隆形成能力主要反映单个细胞增殖能力，一定程度上可以反映细胞存活能力。目前关于bFGF对TDSC的增殖影响研究较多[21-22]，但其具体发挥作用的机制尚不完全清楚。

近年来的研究表明，miRNA在干细胞分裂和分化中起着至关重要的作用。例如，miR-138和miR-23b[23]在干细胞成骨和成软骨自我更新和分化过程中发挥重要作用。血管内皮生长因子通过抑制microRNA-205-5p的表达促进肩袖撕裂肌腱骨愈合[24]。但关于bFGF是否是通过调控miR-222来促进TDSC增殖的相关研究还未见报道。研究显示，miR-222在bFGF诱导的血管重塑通路中主要调节miRNA[14]。同时miR-222可影响人造血干细胞分化[25]。本研究也发现，bFGF可上调miR-222表达，如果抑制miR-222表达，则会削弱由bFGF诱导的促细胞增殖作用。本研究结果提示，bFGF通过上调miR-222促进大鼠TDSC的增殖能力，miR-222可能在大鼠TDSC增殖中发挥重要的调节作用。因此，bFGF/miR-222可能是肌腱修复发展过程中的重要途径，可能成为肌腱损伤修复治疗的新靶点。