刘丽梅, 李志明, 刘新, 陈萍, 徐龙

1银川市中医医院(宁夏医科大学附属中医医院)心病科(宁夏银川 750001)； 宁夏医科大学 2生育力保持重点实验室， 3病理生理实验室(宁夏银川 750004)

冠状动脉粥样硬化性心脏病即冠心病，是临床常见心血管疾病，被全球公认为是致病与死亡的主要原因，并随全球老龄化加剧，其发病率和死亡率呈持续上升趋势[1]。冠状动脉粥样硬化是冠心病主要病理变化，严重影响患者病情及预后，因此，对冠心病患者疾病严重程度进行判定及进行针对性治疗，对降低患者致残率与死亡率极为重要[2]。近年来，有大量研究证实微小RNA(microRNA，miRNA)参与多种疾病发生、发展，有研究发现，miR-135b-5p参与动脉粥样硬化中内皮细胞与血管平滑肌细胞增殖和迁移[3]。血脂代谢紊乱是导致冠心病的重要因素，在动脉粥样硬化中扮演重要角色，有研究发现，血管生成素样蛋白3(angiopoientin-like protein 3，ANGPTL3)与调节脂质代谢功能密切相关[4]。而Gensini积分是反映冠状动脉狭窄程度的重要指标。因此，本研究旨在探讨血清miR-135b、ANGPTL3与冠心病患者Gensini积分的相关性，为其临床治疗及机制研究提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016年3月至2019年3月本院收治的110例冠心病患者进行研究(研究组)，选取同期100例体检健康者作为对照组。

纳入标准：(1)符合冠心病诊断标准[5]；(2)经冠状动脉造影证实；(3)患者知情，签署知情同意书；(4)经本院伦理委员会审查批准。

排除标准：(1)伴先天性心脏病者、心肌病等心血管疾病者；(2)合并甲状腺疾病者；(3)伴活动性肝、肾疾病者；(4)合并严重感染者；(5)近期有影响血脂药物服用史者；(6)伴严重凝血功能障碍者；(7)合并恶性肿瘤者。

研究组男58例，女52例；年龄51～82岁，平均(64.28±6.72)岁；体质指数21.08～24.83 kg/m2，平均(23.14±0.84)kg/m2；美国纽约心脏协会心功能分级：Ⅰ级45例，Ⅱ级35例，Ⅲ级30例；对照组男54例，女46例；年龄53～85岁，平均(65.51±6.32)岁；体质指数21.15～24.95 kg/m2，平均(23.19±0.87)kg/m2，两组受试者性别、年龄、体质指数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 试剂与仪器 Trizol(美国，Invitrogen)、逆转录试剂盒(日本、TAKARA)、荧光定量PCR试剂盒(日本、TAKARA)、ANGPTL3试剂盒(美国，UCL)、普通PCR仪(德国，Biometra)、Roche 480型Real-time PCR仪(瑞士，Roche)、ELx800全自动酶标仪(美国，BioTek)、7020全自动生化仪(日本，日立)。

1.3 方法 (1)血清miR-135b水平检测，采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)检测受试者血清miR-135b水平，miR-135b上游引物序列：5′-CCTGGCTTTTCATTCCTATGTGA-3′，下游引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCCACATATACTAAA-3′，下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′，Trizol提取总RNA，进行逆转录，以逆转录cDNA为模板设计qRT-PCR反应体系进行扩增，反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环，采用2-ΔΔCT方法计算血清miR-135b相对表达量；(2)血清ANGPTL3水平检测，采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清ANGPTL3水平，实验步骤参照试剂盒说明书操作；(3)血脂指标检测，采用全自动生化仪检测受试者血清总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)水平；(4)Gensini积分，应用冠状动脉造影测量左主干、前降支、回旋支及右冠状动脉管腔内径，无狭窄记0分，<25%记为1分，25%～50%记为2分，51%～75%记为4分，76%～90%记为8分，91%～99%记为16分，完全狭窄记为32分，最终积分为各冠脉分支积分之和，得分越高，冠状动脉狭窄程度越严重。

2 结果

2.1 两组受试者血清miR-135b、ANGPTL3水平比较 研究组患者血清miR-135b、ANGPTL3水平均明显高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 两组受试者血清miR-135b、ANGPTL3水平比较

2.2 两组受试者血脂指标比较 研究组患者血清TC、TG、LDL-C水平均显著高于对照组(P<0.05)，HDL-C水平低于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组受试者TC、TG、LDL-C及HDL-C水平比较

2.3 不同冠状动脉狭窄程度血清miR-135b、ANGPTL3水平比较 根据冠状动脉造影结果将患者分为低危组(Gensini积分≤20分)、中危组(21分≤Gensini积分<60分)、重危组(Gensini积分≥60分)，重危组、中危组患者血清miR-135b、ANGPTL3水平高于低危组(P<0.05)，重危组高于中危组(P<0.05)，见表3。

表3 不同冠状动脉狭窄程度血清miR-135b、ANGPTL3水平比较

2.4 冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3水平与血脂指标相关性 冠心病患者血清miR-135b与TC、TG、LDL-C呈正相关(P<0.05)，与HDL-C呈负相关(P<0.05)；血清ANGPTL3水平与TG、LDL-C呈正相关(P<0.05)，与HDL-C呈负相关(P<0.05)，与TC无相关性(P>0.05)，见表4。

表4 冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3水平与血脂指标相关性

2.5 冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3及Gensini积分之间关系 冠心病患者血清miR-135b表达与ANGPTL3、Gensini积分[(53.81±15.48)分]呈正相关(r=0.473，P=0.000；r=0.301，P=0.001)，见图1、2；ANGPTL3表达与Gensini积分呈正相关(r=0.483，P=0.000)，见图3。

图1 冠心病患者血清miR-135b与ANGPTL3表达相关性

图2 冠心病患者血清miR-135b与Gensini积分表达相关性

图3 冠心病患者血清ANGPTL3与Gensini积分表达相关性

3 讨论

冠心病是严重威胁全球人类健康的重要疾病之一，其防治在全球范围内仍是一个巨大的挑战，有调查报道，至2030年，冠状动脉疾病将成为全球四大死亡原因之一[6]。冠心病的致病因素多而复杂，与饮食、饮酒、高血压、糖尿病、凝血功能异常及遗传等因素相关[7]。冠状动脉狭窄程度对患者预后十分重要，冠状动脉造影是冠心病诊断金标准，能较精确的评估患者动脉狭窄程度，但其费用较高，具有辐射危害，且造影剂的使用也可引起一定不良反应。因此，寻找与冠状动脉狭窄密切相关的检测指标，对提高冠心病患者预后有重要临床意义。

miRNA是近年来研究的热点，在个体发育、细胞增殖、凋亡及疾病发生、发展中发挥重要作用。有研究发现，miRNA在脂质代谢及动脉粥样硬化的发展过程中起着重要作用。Ren等[8]研究发现，mir-330能通过调控WNT信号通路靶向作用于丝裂原激活蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)调节血管内皮细胞增殖，其过表达可抑制动脉粥样硬化斑块形成。王玲等[9]研究，mir-24在冠心病血浆中低表达，并与Gensini积分呈负相关，其高表达对冠状动脉起到一定保护作用。miR-135b为新发现的miRNA，在糖尿病、结肠腺癌、骨肉瘤等疾病中异常表达[10]。本研究结果显示，与对照组比较，研究组患者血清miR-135b水平明显升高，提示miR-135b在冠心病患者血清中过表达。ANGPTL3是一种分泌型蛋白质，在人体内主要表达于肝脏，其蛋白分子中的氨基端的螺旋样结构域可调节脂质代谢，而羧基端的纤维蛋白原样结构域参与血管生成[11]。Olkkonen等[12]研究发现，在心血管疾病中以ANGPTL3为治疗靶点，对动脉粥样硬化性心血管疾病有良好治疗效果。本研究结果显示，研究组患者血清ANGPTL3水平明显高于对照组，与Stitziel等[13]研究结果相似，提示冠心病患者血清ANGPTL3水平升高。冠心病患者通常表现为血脂异常，TC、TG、LDL-C、HDL-C是重要的血脂指标，TC、TG易受饮食影响，对冠心病预测价值较小，而LDL-C可促进动脉粥样硬化发生，其水平降低可降低冠心病发病率，HDL-C是抗动脉粥样硬化的脂蛋白，为冠心病保护因子[14-15]。本研究结果显示，与对照组比较，研究组患者TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，提示冠心病患者存在血脂异常现象。进一步研究发现，重危组、中危组患者血清miR-135b、ANGPTL3水平高于低危组，重危组高于中危组，提示血清miR-135b、ANGPTL3水平随着冠心病患者冠状动脉狭窄程度升高而升高。Su等[16]研究报道，在心血管疾病小鼠模型中，ANGPTL3失活可明显降低TG、LDL-C水平，减轻动脉粥样硬化病变大小，改善血脂异常，降低心血管疾病发生风险。本研究结果显示，冠心病患者血清miR-135b与TC、TG、LDL-C呈正相关，与HDL-C呈负相关，血清ANGPTL3水平与TC、LDL-C呈正相关，与HDL-C呈负相关，与Xu等[17]研究结果相似，提示miR-135b、ANGPTL3可能通过调控血脂水平参与冠心病发生、发展。最后研究发现，血清miR-135b表达与ANGPTL3、Gensini积分呈正相关，ANGPTL3表达与Gensini积分呈正相关，提示miR-135b、ANGPTL3与冠状动脉狭窄程度相关，两者可能通过协同作用参与冠心病进展过程。TC、TG、LDL-C水平升高可促进冠心病患者动脉斑块形成，加重患者冠状动脉狭窄程度，miR-135b、ANGPTL3可能通过协同作用调控表达TC、TG、LDL-C、HDL-C表达参与冠心病发生、发展。

综上所述，本研究发现，冠心病患者血清miR-135b、ANGPTL3均高表达，两者表达呈正相关，并与血脂指标、Gensini积分相关，可能成为冠状动脉狭窄程度判定的辅助检测指标。但本研究尚存不足之处，如样本量纳入较少，为单中心研究，有待扩大样本量、开展多中心研究进一步探讨miR-135b、ANGPTL3在冠心病中作用机制，为其临床治疗带来新突破。