王光辉, 张红霞, 许俊丽, 祁元明

1漯河市第七人民医院(漯河市传染病医院)呼吸科(河南漯河 462000)； 2郑州大学生命科学学院(河南郑州 450002)

结核病由结核分枝杆菌感染引起，以肺结核最为常见，临床表现为咳嗽、咳痰、咯血、消瘦等症状。结核病可能随着病情恶化导致多器官发生病变，是全球十大死亡原因之一，病死率居单一传染病首位，是严重的全球性公共卫生问题之一，多药耐药及广泛耐药结核菌的出现增大了肺结核的治疗难度，使结核病的病死率进一步增加[1-2]。目前，肺结核耐药性的形成机制尚不明确，可能与机体免疫反应有关[3]。微小RNA(microRNA，miRNAs)在机体广泛分布，是一种内源性单链非编码RNA，能够调控转录后靶基因表达，参与细胞增殖、分化及凋亡过程，多种miRNAs在耐药结核菌患者中表达异常[4-6]，miR-431与机体免疫反应有关[7]，鲜见报道其与耐药结核菌的关系。Notch信号通路具高度保守性，参与血管形成、胚胎发育、肿瘤发生等生理、病理过程，已有研究发现Notch信号通路能够促进肺干细胞增殖及肺组织修复，与结核病密切相关[8-9]，Notch2是Notch信号通路的重要受体蛋白，在肺癌、肝癌、胶质瘤等多种肿瘤中表达异常，且与预后及化疗抵抗相关[10-11]。本研究旨在探讨miR-431、Notch2在耐药肺结核患者支气管肺泡灌洗液中的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年5月至2019年4月在本院住院的320例活动性肺结核患者进行研究，均符合《肺结核诊断与治疗指南》中活动性肺结核诊断标准[12]，依据WHO《耐药结核病规划管理指南》[13]将活动性肺结核患者分为耐药组(153例)、非耐药组(167例)。耐药组中男92例，女61例，年龄20～72岁，平均(46.26±13.35)岁，其中耐多药肺结核患者112例(耐多药组)，男65例，女47例，年龄(46.72±11.54)岁，耐多药组应符合：对异烟肼、利福平均表现出耐药性。广泛耐药肺结核患者41例(广泛耐药组)，男27例，女14例，年龄(46.03±11.76)岁，广泛耐药组应符合：对异烟肼、利福平、氟喹诺酮三类及卷曲霉素、阿米卡星、卡那霉素3种中任一种表现出耐药性。非耐药组中男97例，女70例，年龄23～72岁，平均(47.81±12.06)岁。排除标准：(1)初治肺结核患者；(2)合并心、肝、肾脏器严重疾病者；(3)合并自身免疫性疾病者；(4)合并恶性肿瘤者；(5)合并妊娠、哺乳女性；(6)合并风湿性疾病者；(7)临床资料不完整。另外选取120例在本院自觉“胸痛”经肺部检查无异常者为对照组，其中男53例，女67例，年龄26～71岁，平均(46.85±11.51)岁。纳入标准：(1)X线检查结果显示肺部未见异常；(2)结核菌素纯蛋白衍生物(purified proteiderivative，PPD)检查呈阴性。排除标准：(1)肺结核病史者；(2)～(7)同肺结核患者排除标准(2)～(7)。耐药组、非耐药组、对照组3组性别、年龄相比，差异无统计学意义(P>0.05)；耐多药组、广泛耐药组两组性别、年龄相比，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 支气管肺泡灌洗液标本采集 肺结核患者行纤维支气管镜检查，依据X线胸片、CT确定灌洗部位，影像学检查未见病变者，选择右肺中叶或左肺舌段进行灌洗，灌洗前告知受检者注意事项并给予耐心指导。用2%利多卡因20 mL对将灌洗肺段进行局部麻醉，将150 mL适宜温度的无菌生理盐水通过纤维支气管镜灌洗导管灌入支气管肺部，灌洗操作分3次轻柔进行，灌洗后以100 mmHg负压回收灌洗液，回收率应>40%，收集支气管肺泡灌洗液5 mL。回收的灌洗液用双层纱布过滤以除去黏液，3 000 r/min离心15 min，保留上清液，-80℃保存待检。

1.2.2 miR-431、Notch2表达检测 采用荧光实时定量聚合酶链反应(Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)检测支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达。采用Trizol法总RNA，反转录为cDNA，进行PCR扩增反应。miR-431正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′，Notch2 mRNA正向引物：5′-GGGACCCTGTCATACCCTCT-3′，反向引物：5′-GAGCCATGCTTACGCTTTCG-3′，内参基因U6正向引物：5′-AGGTGTCTTGCAGGCCGT-3′，反向引物：5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′，反应条件：95℃预变性10 min，95℃ 10 s，60℃ 60 s，40个循环，引物及试剂盒均购于上海酶联生物科技有限公司，操作严格按照说明书进行，采用2-ΔΔCt法计算miR-431、Notch2表达，依据中位数分为miR-431低表达、miR-431高表达；Notch2低表达、Notch2高表达。

2 结果

2.1 对照组、非耐药组、耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达比较 与对照组相比，非耐药组、耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431表达均较高(P<0.05)，Notch2表达均较低(P<0.05)；与非耐药组相比，耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431表达均较高(P<0.05)，Notch2表达均较低(P<0.05)。见表1。

表1 各组支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达比较

2.2 耐多药组、广泛耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达比较 与耐多药组相比，广泛耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431表达较高(P<0.05)，Notch2表达较低(P<0.05)。见表2。

表2 耐多药组、广泛耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达比较

2.3 耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达与临床病理特征关系 miR-431、Notch2表达与性别、结核空洞均无关(P>0.05)，与年龄、吸烟史、耐药情况、病灶所占肺野均有关(P<0.05)。见表3。

表3 耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达与临床病理特征关系

2.4 耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达相关性分析 Spearman分析结果显示，耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达呈负相关(r=-0.556，P=0.000)。见图1。

图1 耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431、Notch2表达相关性分析的散点图

2.5 影响结核病患者是否耐药的多因素logistic回归分析 以结核病患者是否耐药为因变量(非耐药赋值为0，耐药赋值为1)，以性别、年龄、吸烟史、结核空洞、病灶所占肺野、miR-431、Notch2为自变量进行多因素logistic回归分析，将女性、年龄<60岁、无吸烟史、无结核空洞、病灶所占肺野≤3个、miR-431低表达、Notch2低表达均赋值为0，相应地将男性、年龄≥60岁、有吸烟史、有结核空洞、病灶所占肺野>3个、miR-431高表达、Notch2高表达均赋值为1，结果表明，病灶所占肺野>3个、miR-431高表达均是结核病患者发生耐药性的独立危险因素(P<0.05)，Notch2高表达是独立保护因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响结核病患者是否耐药的多因素logistic回归分析结果

3 讨论

结核分枝杆菌是结核病的致病菌，在全球范围内，结核分枝杆菌的感染率可达1/3，结核病是严重威胁人类健康的慢性传染性疾病，中国是结核病高负担国家之一，关于结核病的防治一直受到高度重视。结核菌感染者不一定发展为结核病，对所有感染者进行预防性治疗是不必要且不实际的，应选择结核病的高危人群进行重点防治。耐药结核治疗周期长，治愈率低，更易传播，中国有超过1/2的耐药结核患者为初治患者，进一步增大了结核病的预防性治疗难度，探究耐药肺结核的形成对于结核病的防治形势具有战略性意义[14-15]。

miR-431与肺部发育及肺癌等均有关[16-17]。沈艳青等[17]通过芯片筛选技术发现miR-431在大鼠胎肺发育过程中呈连续低表达，并用连续形态学观察对miR-431表达情况进行进一步验证，发现miR-431在孕19 d表达最高，之后随着肺部发育呈逐渐下降趋势，在出生后3 d miR-431降低至几乎不表达；形态学变化显示孕19 d时胎肺出现板层小体及Ⅱ型肺泡上皮细胞，且随着胎龄增加而增加，出生后肺泡迅速形成，微血管系统逐渐发育成熟，以上提示miR-431在肺发育过程中可能起着负向调控作用，可能参与肺部相关疾病病程。研究发现，肺癌细胞系及组织中miR-431均为低表达，上调miR-431可抑制肺癌细胞增殖、侵袭、迁移，有望成为治疗肺癌的新生物靶点[18]。Notch信号通路与肺癌耐药性的作用机制十分复杂，抑制Notch信号通路能够促进肿瘤细胞凋亡，发挥逆转肿瘤耐药的作用，但另一方面，Notch信号通路也参与肿瘤耐药性的维持[10-11]。研究发现，miR-431在黑色素瘤细胞、组织中均为低表达，且与病情演变密切相关，可用于预后预测，作用机制是miR-431可通过直接靶向作用于Notch2发挥抑制黑色素瘤细胞生长、迁移、侵袭的作用[19]。本研究发现，对照组、非耐药组、耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431表达依次升高，Notch2表达依次降低；与耐多药组相比，广泛耐药组支气管肺泡灌洗液中miR-431表达较高，Notch2表达较低，提示miR-431、Notch2可能参与结核病耐药性的形成及发展；进一步分析显示，耐药组miR-431、Notch2表达与性别、结核空洞均无关，与年龄、吸烟史、耐药情况、病灶所占肺野均有关，且miR-431、Notch2表达呈负相关，提示miR-431、Notch2与耐药结核患者的临床病理特征关系密切，可能成为评估病情的生物标志物，miR-431可能通过调控Notch2表达参与结核耐药性的发生；多因素logistic回归分析结果显示，病灶所占肺野>3个、miR-431高表达均是结核病患者发生耐药性的独立危险因素，Notch2高表达是独立保护因素。miR-431与结核耐药性的发生机制已有研究报道，多耐药基因1(multidrug resistance gene 1，MDR1)在耐药机制中发挥重要作用[20]。Wu等[7]研究发现，结核分枝杆菌感染后，miR-431表达上调，对MDR1的转录调节因子-热休克因子1产生抑制作用，使巨噬细胞中MDR1表达增加，抵抗结核药物，从而提高细胞内结核分枝杆菌存活率，可能是结核耐药性的发生机制之一。

综上所述，miR-431、Notch2在耐药结核患者支气管肺泡灌洗液中异常表达，且与临床病理特征存在相关性，可能成为耐药结核患者的病情评估标志物，也为结核患者耐药性的形成机制提供参考。