李潇南，柳迦鹏，胡 蝶，石玉佩，高 雅，周双海

(北京农学院 动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是一种很小的DNA病毒，猪圆环病毒3型(PCV3)则是新近发现的又一种PCV，能够引起猪皮炎与肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)，并可能引起母猪繁殖障碍[1-2]，对养猪业发展造成了一定经济损失。目前PCV3在多个国家均有报道流行[3-4]，中国也在广东、广西、河北、北京等地发现PCV3的存在[5-7]，表明PCV3已在全球比较广泛存在，是一种需要注意防控的新发传染病病原。

PCV3全基因组大小为2 000 nt，其基因组构成与猪圆环病毒2型(PCV2)相似，都被推测存在11个开放阅读框(open reading frame，ORF)，都是由ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap)[1, 8]，这是病毒唯一的结构蛋白，但2种PCV的Cap氨基酸同源性不足50%。目前，检测PCV3主要是通过PCR方法，尚缺乏商品化的免疫学检测试剂。因此，本研究旨在利用原核表达系统表达与鉴定PCV3-Cap融合蛋白，为PCV3的免疫学检测方法建立打下前期基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒和主要试剂

PCV3全基因组质粒pUC-PCV3、小鼠抗PCV3-Cap血清与原核表达载体pET-32a由北京农学院动物科学技术学院动物疫病研究室制备或保存；Premix TaqTM为TaKaRa公司产品；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒为OMEGA公司产品；大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)和His标签包涵体蛋白纯化试剂盒为北京康为世纪生物科技有限公司产品；限制性核酸内切酶EcoRⅠ、NotⅠ和T4连接酶为Thermo公司产品。

1.2 PCV3-Cap基因片段扩增

用Primer5.0软件设计1对引物，上游引物为5′-CCGGAATTCAACGTCATATCCGTTGGA-3′，下游引物为5′-ATTGCGGCCGCTTAGAGAACGGACTTGTA-5′，扩增产物大小为507 bp。以pUC-PCV3质粒为DNA模板，上、下游引物各25 pmol来建立50 μL的PCR体系。PCR程序为94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 cycles；72 ℃ 9 min。用20 g/L琼脂糖凝胶电泳观察PCR产物并回收预期片段。

1.3 原核表达重组菌的构建

对回收纯化后的PCR产物和pET-32a分别用EcoRⅠ 和NotⅠ 进行酶切，回收二者产物，用T4连接酶进行定向连接，转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)进行增殖培养，菌液PCR鉴定后进行测序鉴定，以筛选出阳性原核表达重组菌。

1.4 表达蛋白的SDS-PAGE分析

取100 μL阳性原核表达重组菌接种到5 mL的LB培养基(含有10 g/L氨苄青霉素)，37 ℃下 160 r/min培养12 h。取3 mL菌液转移到300 mL的LB培养基(含有10 g/L氨苄青霉素)中，37 ℃下160 r/min培养，当菌液OD600值为0.6～0.8时，加入终浓度0～0.8 mol/L的IPTG诱导培养5 h。收集菌体，取一部分进行SDS-PAGE分析；另取一部分进行超声波裂解后，分别收集上清与沉淀，再次进行SDS-PAGE分析。

1.5 Western blot检测

纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE电泳后转移到硝酸纤维素膜上，用5% BSA在室温下封闭1 h，取出膜用TBST洗液洗涤3次，每次5 min。用1∶200倍稀释的小鼠抗PCV3-Cap血清作一抗，4 ℃孵育过夜，用TBST洗液洗涤3次，每次5 min。用1∶2 000倍稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG作二抗，室温下孵育1 h，用TBST洗液洗涤3次，每次5 min。洗涤后用HRP-DAB显色液浸泡约1 min，出现棕色条带后用蒸馏水洗涤以终止显色。另设置pET-32a诱导蛋白作为对照。

2 结果与分析

2.1 原核表达质粒pET-PCV3-Cap的鉴定

以pUC-PCV3全基因组质粒为模版进行PCV3-Cap基因片段的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后显示有1条略大于500 bp的片段(见图1)，与预期结果相符。回收纯化PCR产物后进行重组质粒pET-PCV3-Cap的克隆与测序鉴定。对序列测定结果的BLAST比对显示，克隆的基因片段序列与相应的PCV3-Cap基因片段序列完全一致，表明含有PCV3-Cap基因片段的原核表达质粒pET-PCV3-Cap构建成功。

2.2 目的蛋白的原核表达与可溶性分析

截短的PCV3-Cap蛋白编码168个氨基酸，融合蛋白的分子量约为37.5 kDa。阳性重组菌诱导表达产物经SDS-PAGE后的结果(图2)显示，表达的融合蛋白略大于35 kDa，符合目的蛋白的预期大小，其中以0.5 mol/L的IPTG诱导培养后表达量最多。对目的蛋白的可溶性分析结果(图2)显示，重组蛋白在包涵体与上清中都存在，但以包涵体形式为主。

2.3 目的蛋白的纯化分析

对纯化前与纯化后的包涵体蛋白进行SDS-PAGE，结果(图3)显示，纯化后无可见的杂蛋白，表明纯化后融合蛋白的纯度高。

2.4 目的蛋白的Western blot分析

Western blot检测结果(图4)显示，pET-PCV3-Cap蛋白有明显可见的特异性条带，而pET-32a蛋白未见特异性条带，显示pET-PCV3-Cap能够与小鼠抗PCV3-Cap血清出现免疫学反应，表明目的蛋白能够与其特异性抗体产生免疫学反应，表现出良好的免疫反应性。

3 讨论

PCV3是2016年报道发现的又一种致病性猪圆环病毒，其单独感染能够人工复制出PDNS，且还可能引起母猪繁殖障碍等疾病[1, 9]。PCV3已在美洲、欧洲、亚洲包括中国等地逐渐散播流行[3-7]。目前对PCV3感染的检测主要是采用PCR技术检测病毒核酸，但用免疫学方法检测病毒抗体也是重要方法之一，病毒抗原则是建立PCV3免疫学检测方法的重要材料基础。因此，本研究进行了PCV3衣壳蛋白的原核表达及鉴定。

已有关于PCV2衣壳蛋白的原核表达，多采取截短表达的策略[10]，这是由于PCV2衣壳蛋白基因的N端含有大量稀有密码子而影响目标蛋白在大肠杆菌中的表达所致。由于PCV3与PCV2在基因组组成与结构方面非常相似，一些研究者在进行PCV3衣壳蛋白的原核表达时也是采取了截短后表达的策略。Palinski等[1]去除PCV3 衣壳蛋白基因N端105个碱基来进行原核表达，并基于表达获得的截短蛋白建立了检测PCV3抗体的间接ELISA方法。连凯琪等[11]去除PCV3衣壳蛋白基因N端135个碱基，通过原核表达获得了截短的衣壳蛋白。经分析发现PCV3衣壳蛋白基因的N端同样存在许多稀有密码子，并且是高度碱性，非常不利于目标蛋白的原核表达，故去除其N端包含核定位序列在内的138个碱基而截短至507 nt，该段基因可编码169 aa，相对分子量大小约为37.5 kDa。可以看出，不同研究者的表达策略大体相似，不同之处主要有两个方面：一是截掉的碱基数量不一样，Palinski等[1]和连凯琪等[11]分别截掉了105 nt和135 nt，而截掉了138 nt，截掉的是最多的，但只比连凯琪等[11]多截掉了3个碱基，这个影响可以忽略不计；另一个是采用的原核表达载体不同，Palinski等[1]和连凯琪等[11]使用的是pET-28a或pET-30a，而我们使用的是pET-32a。一般而言，载体分子量越大，则表达量越高。事实证明，本试验表达获得的蛋白含量是比较高的，这很可能与选择使用了分子量更大的表达载体pET-32a有关。

原核表达结果显示，比较高效地表达出了截短的PCV3衣壳蛋白，该蛋白主要以包涵体形式存在，但也有少量的可溶性蛋白。随后的Western blot结果显示该截短的衣壳蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清进行特异性结合，说明表达获得的目标蛋白具有良好的免疫反应性，能够作为PCV3抗体检测方法如ELISA中的抗原材料，为下一步进行PCV3抗体的制备及其免疫学检测方法建立提供了材料基础。