程 昊，张亚楠，张 洁，顾子正，曾天赋美，张 杰

(农业应用新技术北京市重点实验室/植物生产国家级实验教学示范中心/ 北京农学院 植物科学技术学院，北京102206)

观赏海棠红叶品种‘王族’具有紫叶紫花紫果的特征，属于北美海棠[1]，适应性强且树形优美，常被作为园林观赏树木。其颜色的形成主要归因于花色素苷的积累，花色素苷[2]属酚类化合物中的类黄酮类物质，是构成花瓣、叶片等颜色的主要水溶性色素。

与花色素苷生物合成相关的基因主要有两种，一种是不同植物共同具有的结构基因，编码花色素苷生物合成酶；还有一种是调节基因，编码产生的蛋白质结合结构基因或花色素苷生物合成酶，从而影响花色素苷生物合成基因的表达[3]。因此，花色素苷的生物合成除了受其相关结构基因的影响，还会被调节基因影响[4-5]。另外，有学者发现激素也能间接影响花色素苷的生物合成，例如Gen Li[6]于2019年研究积累的ABA能够刺激MYB-bHLH-WD40转录因子复合物的转录，从而上调类黄酮生物合成途径中结构基因的表达，促进花色素苷的产生使果实着色；Jorge Gonza’lez-Villagra[7]于2017年研究发现干旱条件下ABA可能增加miRNA156转录水平，调控花色素苷相关路径基因的表达，从而调节花色素苷的生物合成。

脱落酸(abscisic acid, ABA)普遍存在于植物的叶、休眠芽和成熟的种子中，能抑制植物细胞的分裂和种子萌发，可以提高植物的抗性。已有文献报道在其他物种中ABA能够影响花色素苷的含量，例如：在甜樱桃[8]中，用外源ABA处理会影响PacMYBA的表达，促进花色素苷的生物合成；在无花果[9]中，利用外源ABA和乙烯利处理能够上调花色素苷含量，改善无花果果实的颜色。亦有文献指出ABA处理可以改变苹果果实内源激素的变化，进而导致苹果果实着色的积累和其他一些重要品质增加[10]。

HVA22[11-12]是一种独特的受脱落酸诱导的基因，最早是在大麦糊粉细胞中发现的。它帮助调节胁迫细胞的囊泡转运，降低胁迫细胞的非必需分泌，从而达到提高植物抗性的作用。因此，通过施加外源ABA处理海棠组培苗，对于花色素苷含量进行测定，研究外源ABA对于观赏海棠的着色机理，并对观赏海棠的McHVA22进行克隆，将其瞬时转入组培苗‘王族’中，对于花色素苷路径相关基因进行荧光定量PCR分析，探究观赏海棠中McHVA22对于花色素苷代谢途径的调控。

1 材料与方法

1.1 试验材料

观赏海棠‘王族’叶片于2019年5月到北京市顺义区木林镇蒋各庄村有机观光苹果园中采集，采后分装用冰盒带回实验室，迅速放入液氮中，置于冰箱-80 ℃保存。

瞬时侵染材料为北京农学院组培中心保存的‘王族’海棠组培苗。培养条件：MS培养基(蔗糖30 g/L、琼脂6 g/L、NAA 0.5 mg/L、6-BA 1 mg/L、pH 5.8～6.0)。培养温度 23 ℃±2 ℃，相对湿度 60%～70%，光照强度 1 800～2 000 lx，光照设置 16 h光照/ 8 h黑暗。

1.2 试验方法

1.2.1 植物总RNA的提取和cDNA的反转录 植物材料提取总RNA用艾德莱EASYspin Plus 多糖/多酚/复杂植物RNA快速提取试剂盒 (货号RN5301) ，提取‘王族’叶片中的总RNA，测其浓度并进行电泳检测提取质量，使用全式金两步法RT-PCR试剂盒进行反转录。

1.2.2McHVA22克隆及其过表达载体的构建 因为苹果和海棠高度同源，使用NCBI找到苹果的MdHVA22的相关基因信息，得到该基因在10号染色体上的NC_041802.1位置，找到相对应的mRNA序列号XM_029092122.1，下载CDS区序列。通过Primer 5软件设计引物，正向引物MdHVA22-F: 5’-ATGTTGGGAAGCTTGCTTACCAGAATT-3’；反向引物MdHVA22-R: 5’- TCAGACATGGCGCCGGTTGACTGTG -3’。 以‘王族’叶片反转录得到的cDNA为模板，反应体系为：cDNA 2 μL、 2×EasyPfu PCR SuperMix 25 μL、MdHVA22-F 1 μL、MdHVA22-R 1 μL、H2O 21 μL。反应条件：95 ℃预变性5 min；利用95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，循环35次；然后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。将PCR克隆产物利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒 (艾德莱：DR0102) 进行胶回收，胶回收的产物连接在pEasy-Blunt载体上，转化大肠感受态Trans T1后挑选阳性克隆送公司测序。

将测序正确的质粒与过表达载体pCAMBIA1300-EGFP用限制性内切酶QuickCut Xba I (Takara：1634) 和QuickCut Kpn I (Takara：1618) 进行双酶切，得到的DNA片段和质粒片段，将目的基因、载体质粒与T4 DNA连接酶轻柔混匀后进行金属浴4 ℃连接过夜。

1.2.3McHVA22过表达载体的瞬时转化 采用农杆菌冻融法将5 μL质粒DNA转入50 μL农杆菌感受态GV3101中，涂板培养并挑取单菌落进行PCR鉴定，将正确的菌液继续培养，收集菌液加入侵染液 (10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2、200 μmol/L AS、无菌水) 调节菌液OD值到0.8～0.9。取生长良好且大小相似的‘王族’组培苗，使用真空抽吸的方法将菌液转入组培苗中，用滤纸吸干表面的菌液后接种于培养基 (MS培养基添加300 mg/L头孢和50 mg/L卡那霉素) 中，组培室中培养10 d左右观察表型。

1.2.4 实时荧光定量PCR qRT-PCR的酶选择大连宝日医生物技术有限公司TB Green© Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) (RR420A) ，采用实时荧光定量PCR两步法，94 ℃进行预变性5 min，然后94 ℃变性20 s，用60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环38次。所有用到的荧光引物见表1，待测样品数据均进行3次生物重复。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 花色素苷含量测定 利用可见分光光度计的方法测定花色素苷含量，将待测材料在液氮中研磨成细粉，称取样品0.1 g，用植物花色素苷含量检测试剂盒(索莱宝：BC1380)提取花色素苷，加入提取试剂充分混匀后分别测定在530 nm和700 nm处的吸光值，用计算公式计算得到花色素苷含量。

2 结果与分析

2.1 ABA处理‘王族’海棠组培苗

分别用0.025 mg/L、0.05 mg/L、1 mg/L的ABA质量对于观赏海棠 ‘王族’组培苗进行处理，可以观察到图1中随着ABA浓度的增加，‘王族’组培苗的颜色也在增加。不同浓度ABA处理的组培苗进行花色素苷含量的测定结果图2可以看到。随着ABA浓度的递增，花色素苷的含量也在递增。由此可知，花色素苷含量可随ABA处理的浓度增加而增加。

2.2 McHVA22过表达载体的构建以及瞬时遗传转化

以观赏海棠‘王族’叶片作为克隆模板cDNA，PCR扩增得到630 bp的McHVA22片段，进行琼脂糖凝胶电泳检测，条带正确的切胶后进行胶回收，得到的产物重新进行琼脂糖凝胶电泳检测，二次检测成功的连接普通克隆载体，转化大肠后送公司测序。序列比对正确的连接过表达载体pCAMBIA1300-EGFP，用限制性内切酶QuickCut Xba I和QuickCut Kpn I进行双酶切，并连接转化，送公司测序，序列比对后将McHVA22过表达载体通过农杆菌转化法瞬时转化入‘王族’组培苗中，培养10 d左右观察表型。

由图3中与对照植物相比，可以观察到瞬时转化McHVA22过表达载体的组培苗明显变红。对于花色素苷路径主要基因(PAL、CHS、CHI、UFGT)进行荧光定量PCR检测后，发现与对照相比，花色素苷相关路径基因呈现显著增加的趋势。其次，对于影响花色素苷合成的转录因子(MYB4、MYB10)进行荧光定量PCR检测后，结果如图4所示，与对照相比，调控花色素苷相关转录因子也呈现显著增加的趋势。与此同时，测定了瞬时转化McHVA22过表达载体的组培苗的花色素苷的含量后发现瞬时转化McHVA22过表达载体的组培苗的花色素苷含量显著高于对照转化的组培苗。因此，可得到McHVA22能够正调控花色素苷路径基因，进而调节花色素苷的积累，促使叶片颜色变红。

3 讨 论

观赏海棠种类繁多，花色丰富绚丽，其叶片、果实颜色近年来研究甚多[13-14]，而花色素苷是影响其颜色的重要物质。在大部分被子植物的不同器官当中都能检测到花色素苷的存在，包括果实、花朵、茎和叶，花色素苷是构成花瓣、果实等颜色的主要水溶性色素。此外，花色素苷在抗癌、抗炎、抗自由基、降血糖等方面均有重要作用[15]。但是花色素苷的生物合成易受各种因素的影响，如光照、水分、激素、矿物质元素等，因此对于花色素苷的研究就显得极为重要。

ABA作为激素对于花色素苷的调控起到了不可忽视的作用，果实着色是果实成熟的一个重要标志，在这个过程中ABA起到了重要的作用。在荔枝[16]中，内源ABA含量在叶绿素降解时急剧增加，ABA水平在花色素苷开始积累之前达到峰值，表明ABA在荔枝果实着色过程中起着重要作用。在其他果实，如苹果、甜樱桃、无花果等皆有报道。

在植物中，HVA22在不同的组织中普遍表达，例如种子，芽和根，并且会受ABA介导的几种环境胁迫条件(例如寒冷和干旱)诱导。最近的研究中，ABA处理能够改变内源激素的平衡，从而调控苹果果实着色的积累，而HVA22能够受ABA诱导产生，因此推测HVA22是否与花色素苷的调控产生联系。通过研究发现，ABA能够诱导观赏海棠叶片花色素苷的积累，且McHVA22能够正调控观赏海棠叶片中花色素苷路径基因的相对表达水平，从而增加花色素苷的积累。因此，本研究为HVA22对于花色素苷的调控提供了一定的理论基础。