赵志显，邢 凯*，常雪蕊，齐晓龙，盛熙晖，倪和民， 王相国，肖龙菲，王楚端，郭 勇

(1.北京农学院 动物科学技术学院，北京102206；2.中国农业大学 动物科学技术学院，北京 100193)

miRNAs是一段长18～22nt的微小的内源性非编码RNA分子，它在转录后调节基因的表达。基因表达调控是通过与靶mRNAs的不完全碱基配对来完成的，导致mRNA的降解或抑制蛋白翻译，使mRNA指导蛋白的合成受到干扰[1]。miRNAs由哺乳动物基因组的1%～5%组成，生物信息学分析显示，超过60%的哺乳动物基因可能被单个miRNA作为靶标。细胞内和细胞外的miRNAs都被发现参与调节哺乳动物细胞或组织的基因表达。由于更广泛的靶向能力，miRNAs还被发现参与了大多数生物过程和细胞途径[2]。有研究表明，猪的脂肪沉积受多个miRNA和基因的调控，并通过改变与脂肪沉积相关的信号通路而发挥作用。刘玉芳等[3]研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子1α(PPARGC1A)基因能够负调控猪脂肪沉积过程。王颖萍[4]研究表明ssc-miR-4332、ssc-miR-4338、ssc-miR-127、ssc-miR-424为脂肪沉积过程的负调控因子, ssc-miR-194、ssc-miR-545、ssc-miR-22为猪脂肪沉积过程的促进因子。

miR-17-3p高表达于多发性骨髓瘤病人[5]和结肠癌患者[6]，在胃间质瘤[7]和寻常型银屑病患者皮损及外周血[8]中表达下调。有研究发现[9]，miR-17-3p及其靶基因可以调控猪卵巢从卵泡期向黄体期的发育过程。miR-17-3p等组成的miR-17簇在脂肪细胞分化的克隆扩增阶段显著上调[10]。此外，miR-17-3p在3T3-L1细胞系成脂分化中发挥了作用[11]。然而，可能针对ssc-miR-17-3p转录并调控猪脂肪沉积的靶基因和信号通路尚无研究。因此，当前的研究旨在使用生物信息学分析方法鉴定ssc-miR-17-3p候选靶基因及调控脂肪沉积的候选靶基因，更加深入的了解microRNA对脂肪沉积的所作用的机制，为猪的育种与培育提供更有力的理论依据。

1 材料与方法

1.1 miRNAs序列相似性分析

根据NCBI中的序列，进行保守性分析，获得miR-17-3p在各个物种的参考序列，分析各个物种与猪 miR-17-3p之间的序列相似性。miRNA在不同的哺乳动物物种中得到了广泛的保存，因为这一特性所以能够使用人类miRNA引物来研究与猪相同的miRNA，在软件中进行相关候选靶基因预测。

1.2 预测miR-17-3p候选靶基因

采用miRDB(http://mirdb.org)[12]，miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de)[13]和TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)[14]3个在线数据库分别对hsa-miR-17-3p进行候选靶基因预测。采用Venny(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)[15]在线软件对上述3个数据库预测的候选靶基因取交集。3个数据库的共同候选靶基因与已得到的371个与猪脂肪相关的差异表达基因[16]再次取交集，从中筛选出一部分参与脂肪沉积的候选靶基因。

1.3 KEGG/GO功能富集分析和潜在调控网络绘制

采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[17]在线数据软件获得miR-17-3p候选靶基因参与的KEGG/GO通路，采用R语言软件对获得的候选靶基因进行KEGG/GO功能富集分析。

对筛选出的参与脂肪沉积的候选靶基因进行如下分析：采用KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/genelist/)[18]在线数据软件获得候选靶基因参与的通路，然后采用Cytoscape(https://cytoscape.org/)可视化工具进行潜在调控网络绘制。

2 结果

2.1 miRNAs序列相似性分析结果

获得了猪及其他多个物种miR-17-3p引物序列，进行了序列相似性研究，通过分析发现，猪miR-17-3p引物序列与人和一部分啮齿类动物序列完全一样(表1)。

2.2 miR-17-3p候选靶基因预测与功能富集分析结果

通过预测hsa-miR-17-3p候选靶基因，在miRDB数据库中，得到了657个候选靶基因；在miRWalk数据库中，得到了12 986个候选靶基因；在TargetScan数据库中，得到了5 541个候选靶基因。通过Venny取交集，得到了3个数据库的486个共同候选靶基因。通过对486个共同候选靶基因做KEGG/GO功能富集分析，DAVID结果显示,在KEGG通路中，候选靶基因参与了36个生物学过程，包括碳水化合物的消化吸收、胰高血糖素信号通路、催乳素信号通路和MAPK信号通路等，部分结果见图1。在GO聚类中，候选靶基因参与了159个生物学过程，包括脂肪细胞分化的负调控、琥珀酸代谢过程、核、蛋白质结合和转录调控等，部分结果见图2。

2.3 miR-17-3p潜在调控网络

miR-17-3p是通过高通量测序在不同背膘厚度长白猪脂肪组织中发现的一个差异表达miRNA，且在背膘组中显著高表达。在同样的样本中，发现了371个差异表达的基因[16]。其中13个靶基因也在差异表达基因列表中，包括TSTD2、CSDE1、SCGB1D1、TEAD1、GPD2、NFATC3、MBNL1、PPP1R12B、CAMK2D、HBEGF、LRRC28、UBE2D4、MAP4。在这13个重点候选靶基因中， CSDE1、TEAD1、GPD2、NFATC3、MBNL1、PPP1R12B、CAMK2D、HBEGF参与了脂肪代谢的过程。其中GPD2参与了脂质代谢、甘油磷脂代谢，糖醇代谢等过程；CAMK2D参与了催产素信号通路、ErbB信号通路，胰高血糖素信号通路等；HBEGF参与了GnRH信号通路，磷代谢过程，甲状旁腺激素的合成，分泌和作用等；其他基因参与了大分子代谢过程，细胞代谢过程等(图3)。

3 讨 论

在对13个重点候选靶基因做功能富集分析时，发现催产素信号通路显著富集，有研究表明[19]，催产素(OXT)直接作用于脂肪细胞上的OXT受体，来抑制白色脂肪到米色脂肪转变基因程序，白色脂肪细胞的褐化(也称为米色细胞)被证明是通过消耗储存的脂质来执行产热作用的，这与代谢动态平衡高度相关[29]。而注射OXT可能会通过对OXT能神经元的作用而减少体内总脂肪。此外，McCormack S E等[20]在小鼠模型中发现，缺乏OXT信号的小鼠表现出胰岛素敏感性降低和葡萄糖漂移增加，而缺乏OXT受体的小鼠腹部脂肪垫增厚和甘油三酯增加。对于GnRH信号通路，王作伟等[21]的GnRH主动去势免疫公猪试验表明，GnRH主动免疫使公猪肝脏脂肪合成能力增强，与传统手术去势公猪相比，脂肪合成能力降低，瘦肉率提高。Mackay J等[22]用含GnRH类似蛋白结合物的疫苗接种公猪，能够使脂肪中不饱和脂肪酸的含量提高。促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)通路是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其家族控制着各种重要的生理性过程,包括细胞的生长、分化、增殖、死亡。MAPK信号通路在脂肪细胞分化的过程中起着非常重要的作用,能直接影响脂肪因子、脂肪细胞分化基因的表达[23]。

ssc-miR-17-3p候选靶基因中，3-磷酸甘油脱氢酶(GPD2)，可以催化3-磷酸甘油酯转化为磷酸二羟基丙酮酯。GPD2与GDP1一起构成了磷酸甘油酯穿梭反应。Kim Y H等[24]在人绒毛膜间充质干细胞成脂分化过程中的基因表达谱试验中将GPD2作为标志基因，用于检测脂肪细胞分化。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIδ(CAMK2D) 的产物属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，并属于Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶亚家族。研究发现，在肥胖大鼠中，细胞内钙信号转导中起重要作用的CAMK2D表达上调[25]。肝素结合性表皮生长因子(HB-EGF)是EGF家族中的一个肝素结合成员，被发现于人巨噬细胞培养液的中间产物中，因与肝素有很强的结合力而得名[26]。可溶性成熟的HB-EGF是由较大的膜锚定前体蛋白水解而成，对成纤维细胞、平滑肌细胞是一种有效的有丝分裂原和趋化因子[27]。Matsumoto S等[28]研究表明，HB-EGF mRNA在人脂肪组织中大量表达，肥胖小鼠脂肪组织中HB-EGF mRNA表达增加，人血浆HB-EGF水平随脂肪堆积而升高。此外Hung C S等[29]研究表明，MBNL1自身调节参与了整个米色脂肪形成过程中MBNL1转录本的剪接过程。

综上所述，ssc-miR-17-3p可能通过调控GPD2、CAMK2D、HB-EGF、MBNL1等候选靶基因，进而参与猪脂肪细胞的生成、分化和代谢，以及调控催产素信号通路、GnRH信号通路、MAPK信号通路等。通过这些发现，将有力支持ssc-miR-17-3p参与猪脂肪沉积调控机制的探索。