贾丽君 尹晓然 昝瑛

(西安交通大学第二附属医院肿瘤科，陕西 西安 721000)

乳腺癌是女性易患的恶性肿瘤之一，其中，乳腺癌又分为原发性乳腺癌和继发性乳腺癌。原发性乳腺癌是指发生于乳腺本身，而不是继发于其他组织器官转移而形成的恶性肿瘤；继发性乳腺癌是指其他部位癌细胞转移至乳腺，最终形成乳腺癌[1]。甲基莲心碱 (Neferine, Nef)是一种双苄基异喹啉类生物碱，具有降压、抗血栓形成、抗氧化等多种临床作用。最近相关研究发现，Nef对乳腺癌细胞具有一定作用，但具体作用效果及机制尚未明确[2]。Survivin 属于凋亡抑制蛋白(Inhibitor of Apoptosis Protein, IAP)家族，Survivin会在多种人类肿瘤中过度表达[3]。Survivin的过量表达抑制细胞凋亡，并促进肿瘤的进展和对抗癌药物和放射线的抵抗，但尚不清楚Survivin在乳腺癌细胞中的作用机制[4]。RASSF2是新近发现的抑癌基因，对肺癌、肝癌等癌细胞的生长具有明显抑制作用，但对乳腺癌细胞的作用研究报道较少[5]。因此，本研究旨在探讨Nef对乳腺癌细胞survivin、RASSF2基因的调控及细胞凋亡的情况。

1 材料与方法

1.1 一般材料 将在ATCC细胞库购买的乳腺癌细胞株zr-75-30细胞分为癌细胞组(CC组)：单纯zr-75-30细胞不做其他处理，正常培养；低浓度组(LC组)：将zr-75-30细胞与浓度为5 mg/kg Nef混合培养；中浓度组(MC组)：将zr-75-30细胞与浓度为10 mg/kg Nef混合培养；高浓度组(HC组)：将zr-75-30细胞与浓度为20 mg/kg Nef混合培养。

1.2 实验仪器与试剂 Nef(大连美仑生物技术有限公司)；PVDF 膜(Millipore，美国)；高压灭菌锅(Hirayama Manufacturing，日本)。

1.3 细胞培养 将zr-75-30细胞株在含有胎牛血清的DMEM培育液中培养。当细胞数量为80%～90%时，胰蛋白酶消化zr-75-30细胞，消化后，采取1600 r/min进行离心，时间为5 min，收集、重悬并培养细胞。将细胞接种在96孔板上，密度为1×104个细胞/孔，在5%CO2+95%空气的混合气体中培养过夜，然后加入5、10、20 mg/kg浓度的Nef混合液培养24 h。

1.4 Hoechst 33258 荧光染色法检测zr-75-30凋亡 按 Hoechst 染色试剂盒说明书操作[6]。荧光显微镜下观察并拍摄图片，以细胞皱缩、胞核致密浓染、荧光强度增强等作为细胞凋亡指标。

1.5 流式细胞仪检测zr-75-30细胞凋亡情况 调整zr-75-30细胞密度为1.2×106/L，接种于6 孔板中，处理12 h，继续培养24 h。0.01 mol/L PBS洗涤，300×g离心5 min，置-4 ℃冰箱培养，PBS洗涤3次，37 ℃水浴30 min，吹打均匀，4 ℃避光孵育30 min。使用Guava流式细胞仪进行流式上样检测。

1.6 Western blot法检测zr-75-30细胞中survivin的蛋白含量 将zr-75-30细胞进行裂解并提取核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在-20 ℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均，按照4∶1的比例进行，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。把电泳后的50 μm蛋白样品转移到PVDF膜上，加入脱脂奶粉，并进行封闭，时长为1 h。加入1抗后进行TTBS漂洗，每次漂洗10 min，一共进行3次漂洗，最后加入2抗对溶液进行稀释，再在常温的环境中封闭1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，DAB显色后数码相机照相。

1.7 免疫组化法检测zr-75-30细胞中RASSF2的蛋白含量 将zr-75-30细胞入二甲苯中处理，完成后，再分别浸入不同浓度的酒精中。在100 mL 0.01 mol枸櫞酸缓冲液冲洗、浸泡，PBS冲洗3次，加热修复15 min，冷却至室温。冲洗，室温封闭，滴加一抗(兔抗人RASSF2抗体)37 ℃ 30～40 min，冲洗，滴加生物素化二抗37 ℃ 40 min，冲洗，DAB显色，水洗终止反应，苏木素复染，分化，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。

1.8 qRT-PCR法检测zr-75-30细胞中survivin、RASSF2 mRNA的表达含量 把保存在-80 ℃环境中的zr-75-30细胞取出。将液氮冷冻中的zr-75-30细胞进行研磨, 用Trizol进行总RNA的提取，逆转录按照说明书严格进行，将逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验。所有反应严格按照反应的条件进行扩增，内参采用GAPDH，变性3 min 95 ℃，变性5 s 95 ℃，退火1 min 60 ℃，一共40个循环。取得到的平均值后得到Ct值，计算方法用2-△△Ct法进行分析，见表1。

2 结果

2.1 Hoechst 33258 荧光染色法检测zr-75-30细胞凋亡情况 CC组、LC组、MC组及HC组细胞凋亡数量分别为(156.25±56.24)、(247.01±63.84)、(297.35±70.14)、(516.54±102.36)个。CC组zr-75-30细胞荧光强度较弱，凋亡数量较少，LC组、MC组及HC组细胞的细胞核出现核固缩的概率显著高于CC组(均P<0.05)；其中，HC组与LC组、MC组相比，HC组细胞凋亡细胞数量最多(P<0.05)，见图1。

表1 引物序列

图1 各组细胞凋亡情况

2.2 流式细胞仪检测zr-75-30细胞凋亡情况 CC组、LC组、MC组及HC组细胞凋亡率分别为0.31±0.09、0.45±0.12、0.64±0.18、0.76±0.21。HC组zr-75-30细胞凋亡数量最多，凋亡率最高；CC组zr-75-30细胞凋亡数量最少，凋亡率最低；LC组、MC组细胞的凋亡数量显著低于HC组(均P<0.05)，见图2。

图2 各组乳腺癌细胞凋亡率

2.3 Western blot法检测zr-75-30细胞中survivin的蛋白含量 通过Western blot法，CC组、LC组、MC组及HC组zr-75-30细胞内的survivin蛋白含量分别为1.21±0.35、0.79±0.16、0.51±0.11、0.30±0.09。CC组zr-75-30细胞survivin蛋白表达高于LC组、MC组及HC组(均P<0.05)；LC组细胞survivin蛋白表达高于MC组、HC组(均P<0.05)，见图3。

2.4 免疫组化法检测zr-75-30细胞中RASSF2 的表达情况 在zr-75-30细胞中RASSF2阳性染色，呈现紫色颗粒。HC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数较多，而在CC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数较少。HC组与LC组、MC组相比，HC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数明显较高(均P<0.05)。见图4。

图3 各组细胞中survivin的蛋白含量

图4 各组细胞中RASSF2的表达

2.5 qRT-PCR法检测zr-75-30细胞中survivin、RASSF2 mRNA的表达含量 CC组、LC组、MC组、HC组zr-75-30细胞中的survivin mRNA表达量分别为1.03±0.21、0.76±0.16、0.61±0.14、0.37±0.08，RASSF2 mRNA表达含量分别为0.43±0.09、0.73±0.14、0.85±0.18、1.06±0.26。HC组zr-75-30细胞中的survivin mRNA表达量最低，CC组zr-75-30细胞中表达量最高；HC组与LC组、MC组相比，survivin mRNA含量明显较低(均P<0.05)，RASSF2 mRNA表达含量与survivin相反，见图5。

图5 各组细胞中survivin、RASSF2 mRNA表达含量

3 讨论

乳腺癌发病率已位居妇科癌症首位。中国属于发病率较低的国家，但是，近年来增长速度却持续升高[7]。我国乳腺癌患者年龄逐渐下降，平均比其他国家女性早10～15年。现今，乳腺癌已引起临床及科研人员高度关注[8]。虽然现在手术治疗，术后的化、放疗发展迅速，但仍不能阻碍癌细胞转移。乳腺癌的转移、复发严重影响患者的康复时间，给治疗增加了很多困难[9-10]。近年来，国内在治疗乳腺癌方面获得了较多成就，但癌细胞转移情况时有发生，发生率也同样居高不下[11]。与其它肿瘤的发生相似，乳腺癌癌变是一个长期、多步骤的疾病过程，涉及了复杂的遗传表观、遗传异常等[12]。对乳腺癌患者转移情况的进行把控，缓解患者治疗时所受的痛苦，抑制肿瘤发展是目前医学界研究的重点。

Nef属于中药及天然药物提取范畴，近年来，其医学作用逐渐被证实。临床试验研究显示，Nef在多种疾病中均有一定作用，如肺癌、高血压等[13]。临床中，Nef对乳腺癌细胞存在一定作用，但具体机制尚未可知。本研究结果显示，CC组zr-75-30细胞荧光强度较弱，凋亡数量较少，LC组、MC组及HC组细胞的细胞核出现核固缩的概率显著高于CC组，其中，HC组与LC组、MC组相比，HC组细胞凋亡细胞数量最多(均P<0.05)。HC组zr-75-30细胞凋亡数量最多，凋亡率最高；CC组zr-75-30细胞凋亡数量最少，凋亡率最低；LC组、MC组细胞的凋亡数量显著低于HC组。Nef具有抗炎、降血压等多重作用，在心律失常、肿瘤等多种疾病中具有治疗作用[14]。有临床实验研究显示，Nef能预防动脉粥样硬化和再狭窄的产生，同时可抑制多种癌症疾病的发展速度，达到治疗效果。Nef浓度能够显著影响乳腺癌细胞的活性，与癌细胞的恶性度关系显著，Nef浓度越高，能使其恶性度显著下降，这与乳腺癌的治疗率及复发率有显著关系[15]。温海燕等[16]研究显示，Nef以时间和浓度依赖的方式抑制乳腺癌细胞增殖、细胞毒性增加，导致细胞周期于G0/G1阻滞并促进癌细胞凋亡。Nef抗乳腺癌的可能作用机制是激活线粒体凋亡途径。唐小卿[17]研究显示，Nef能逆转MCF 7/Adr细胞的凋亡抗性，其作用机制可能与抑制P gp的功能和表达、增加ADR在MCF 7/Adr细胞内的积累有关。

本研究结果显示，HC组zr-75-30细胞中survivin蛋白表达最低，CC组zr-75-30细胞survivin蛋白表达高于LC组、MC组、HC组，LC组细胞survivin蛋白表达高于MC组、HC组。CC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数较少，HC组与LC组、MC组相比，HC组zr-75-30细胞中RASSF2阳性数显著较高。HC组zr-75-30细胞中的survivin mRNA表达量最低，CC组zr-75-30细胞中表达量最高；HC组与LC组、MC组相比，HC组zr-75-30细胞中survivin mRNA含量明显较高，RASSF2 mRNA表达含量与survivin相反。细胞凋亡调节异常通过异常延长细胞存活、促进转化突变的积累和增强对免疫监视的抵抗力而与癌症发生有关。最近，survivin作为IAP家族的一个新成员引起了广泛的关注，并参与细胞凋亡和细胞周期进程的调节。基于其抗凋亡功能，survivin的干扰蛋白表达降低了人类异常有丝分裂细胞的生存力，抑制肿瘤的发展，并促进肿瘤细胞的凋亡[18]。通过抑制Survivin基因的表达，细胞凋亡会明显增加，survivin可能是包括乳腺癌在内的肿瘤的重要治疗靶点。侯歌等[19]研究显示，对Survivin表达水平的检测有望成为乳腺癌含紫杉醇化疗方案的预测指标，且针对Survivin高表达患者联合复方苦参注射液可能提高化疗的有效率，甚至延长PFS。RASSF2是RASSF家族重要成员，在多种人类肿瘤中均存在其异常甲基化而表达沉默。RASSF2具有促进凋亡和细胞周期停滞、抑制生长的作用[20-21]。在肿瘤大鼠体内RASSF2高表达能减缓大鼠癌细胞扩散生长，同时，下调RASSF2的表达含量能够促进癌细胞增殖，表明RASSF2与肿瘤的发展有密切关系[22-23]。马腾飞等[24]研究显示，5-Aza-CdR可通过逆转RASSF2A基因异常甲基化导致该基因表达上调来抑制MCF-7细胞增殖，RASSF2A是一个乳腺癌相关抑癌基因。有研究报道，Nef可能通过靶向作用于多种蛋白促进乳腺癌细胞凋亡等生物学过程。因此，采用Nef达到治疗乳腺癌的目的，为乳腺癌的诊断和治疗发展新方向[25]。

4 结论

Nef对乳腺癌(zr-75-30)细胞的凋亡存在促进作用，且与浓度呈正相关，在20 mg/kg浓度下促进效果最佳，其作用原理可能与Nef抑制细胞中survivin表达及上调RASSF2表达有关。