刘光霞 赵连春 陈芳 牛丽霞 卢亚敏 高伟 侯瞻

(1.河北省人民医院核医学科，河北 石家庄 050051；2.河北以岭医院检验科，河北 石家庄 050091;3.河北省人民医院检验科， 河北 石家庄 050051)

甲状腺滤泡癌严重危害人们健康，病变的形成、进展与多种遗传物质及细胞因子的改变有关[1]。微小RNA(miRNA)是近年关注到的与肿瘤形成有关的基因，是由19-25个核苷酸组成的非编码单链小RNA，通过与目标基因非翻译区结合，调控细胞的异型增殖[2-3]。本研究应用TCGA、NCBI GEO Data Sets数据库进行交叉筛选，选取与甲状腺滤泡癌密切相关、文献报道鲜少的微小RNA-215-5p(miR-215-5p)进行研究，分析其在肿瘤中的表达特征，并探讨miR-215-5p与促甲状腺激素(TSH)的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般材料 选取2014年3月～2017年4月河北省人民医院和河北以岭医院确诊为甲状腺滤泡癌行手术治疗的55例患者术后组织为观察组。纳入标准：①均为明确诊断的甲状腺滤泡癌，并由病理医师复核切片。②首次确诊。③临床及病理资料齐全。排除标准：①诊断有异议者。②术前行放、化疗者。③随访资料不全或家属不同意观察者。留取术前血清标本及术后组织标本。另选取55例经病理确诊为甲状腺滤泡性腺瘤为对照组。留取术后组织标本。本研究经医院伦理委员会审核并批准。

1.2 实验方法

1.2.1 miR-215-5p检测 应用实时荧光定量PCR法检测两组中miR-215-5p的表达。采用TRIZOL试剂(美国，Invitrogen公司)提取细胞总RNA后，通过逆转录实验合成cDNA(日本，TaKaRa公司)，按照相应qPCR试剂盒说明书检测miR-215-5p水平。引物由上海碧云天公司合成，miR-215-5p上游引物：5′-GTCAACCATCGCTGCATCCAC-3′；下游引物：5′-GACTGACGACGTCCGTGCCAC3′。以U6为内参，引物上游：5′-GGAAGTAGCACCTGATTAGC-3′下游：5′-TTGGAATACGAATTCCG-3′。扩增反应条件：95 ℃ 8 min。95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，31个循环。将miR-215-5p的表达针对U6标准化，采用2-△△Ct表示相对水平进行分析。

1.2.2 免疫组化法检测Ki67的表达 应用免疫组化SP法检测甲状腺滤泡癌组织中Ki67的表达。Ki67浓缩液和DAB均购自武汉博士德生物技术公司。基于石蜡包埋组织进行检测，切取4 μm切片。先按不同比例进行预实验，选择预实验中显色最理想的浓度(Ki67为1∶200)用于正式实验。正式实验均由同一技师操作，DAB显色。阳性部位是细胞核，选择5个400倍视野(热点区)进行观察，计算阳性率的平均值。Ki67的阳性率亦称为增殖指数。

1.2.3 电化学发光法检测血清中TSH的表达 抽取术前患者的空腹静脉血，4000转/min离心15 min后，应用电化学发光法检测血清中TSH的表达。做好质控工作，减少人为误差。

2 结果

2.1 患者的一般资料 甲状腺滤泡癌患者共55例，其中男性29例，女性26例；年龄32～78岁，中位年龄57岁；肿瘤最大径1～7.8 cm，平均(4.2±1.2)cm; TNM分期Ⅰ期32例，Ⅱ期13例，Ⅲ期8例，Ⅳ型2例。对照组共55例，其中男性28例，女性27例；年龄28～75岁，中位年龄56岁。两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)。病理形态见图1。

图1 病理形态图(200×)

2.2 两组miR-215-5p 表达的比较 观察组miR-215-5p的表达量(1.36±0.09)明显低于对照组(2.29±0.18)，差异有统计学意义(t=6.57，P=0.002)，见图2。

2.3 miR-215-5p在不同临床病理特征分组中表达的比较 miR-215-5p 的表达在不同肿瘤最大径、Ki67增殖指数和TNM分期的分组中差异有统计学意义(均P<0.05)。而在不同性别、年龄的分组中差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图3。

图2 miR-215-5p在两组中表达的比较

表1 miR-215-5p在不同临床病理特征分组中表达的比较

图3 Ki67的表达(200×)

2.4 miR-215-5p 表达的生存分析 患者均进行术后3年的随访，截止时间点为2020年1月31日。其中，存活39例，死亡9例，失访7例。死亡患者确诊后的生存时间为6～36个月，中位生存期为21个月。以miR-215-5p表达的平均值(1.36)为临界值行K-M生存分析，显示miR-215-5p的表达与预后相关(2=5.46，P=0.028)，即miR-215-5p低表达患者的预后差，见图4。

图4 miR-215-5p 表达的生存分析

2.5 观察组miR-215-5p与血清TSH的相关性 电化学发光法检测到血清中TSH的表达范围为0.27～4.20 μIU/mL，平均为(3.12±1.16)μIU/mL。相关分析显示，血清中miR-215-5p 与TSH呈负相关(r=-0.61，P=0.012)，见图5。

图5 miR-215-5p与TSH的相关性

3 讨论

甲状腺滤泡癌发生机制涉及多种分子生物学通路，与DNA、RNA及蛋白的表达失调均有关[4]。近年学者认为，P53和细胞增殖是甲状腺滤泡癌病变形成的经典途径[5]，并发现其影响因素较多。近年学者关注到miRNAs异常表达对肿瘤的进展有促进作用[6-7]，并发现了多种对甲状腺异常增殖细胞中有影响的P53和增殖调控的miRNAs[8]。因此，本研究在实验前进行筛查，选择miR-215-5p进行实验研究，同时也发现miR-215-5p异常表达对肿瘤细胞增殖和凋亡有一定的调节作用[9-10]。有资料显示，miR-215-5p在人体正常的组织和细胞中具有一定的表达量，而在肿瘤性病变中常伴有miR-215-5p表达的下调[11]。miR-215-5p可能作为肿瘤抑制基因发挥作用。miR-215-5p下游基因较多，包括增殖相关基因、转移相关基因等[12-13]。

本研究结果显示，甲状腺滤泡癌中miR-215-5p低表达，提示miR-215-5p低表达对肿瘤的形成有促进作用。miR-215-5p具有抑癌基因样的作用，通过与下游靶基因的3′UTR结合调控mRNA实现其功能[14-15]。本研究结果亦显示，miR-215-5p 的表达在不同肿瘤最大径、Ki67增殖指数的分组中差异有统计学意义(P<0.05)，提示miR-215-5p低表达预示肿瘤处于较高的增殖状态，肿瘤生长快，对周围的侵袭性强[16]。从细胞动力学角度分析，正常甲状腺上皮细胞属于稳定状态的细胞群，其细胞增殖和死亡的速度均较低，在肿瘤性因素的刺激下发生明显增殖，miR-215-5p的异常表达使增殖平衡打乱，正调节和负调节失平衡，细胞增殖旺盛。miR-215-5p是细胞分化等多种生理过程的关键调节因子，miR-215-5p介导的复杂而精确的调控网络机制在维持细胞增殖的动态平衡中具有关键作用。有研究显示，miR-215-5p异常表达可以调控CTCF的翻译来降低GATA4、NKX2.5和WNT的表达量[8]，这表明miR-215-5p的调控是多元性的，其调控机制复杂。生存分析发现，miR-215-5p的表达与预后有关，提示miR-215-5p可能对判断预后有一定价值，即miR-215-5p低表达的患者生存时间短，预后差。这与miR-215-5p在不同TNM分期的表达中差异有统计学意义的结论一致。但是miR-215-5p对预后判断的应用尚需要后续进行多中心、大样本及多因素分析后进一步明确。本研究发现，甲状腺滤泡癌组织中miR-215-5p 与血清TSH呈负相关，提示两者可能具有协同作用，但机制不清楚。由于TSH由垂体分泌，可能与miR-215-5p作为调节内分泌细胞的因子有关[17-18]。也有学者在垂体瘤中发现多种miRNAs表达[19]，这可能是两者具有关系的机理之一，两者的关联性为后续研究miR-215-5p提供了创伤性小及取材容易的方法。

4 结论

miR-215-5p在甲状腺滤泡癌中的表达下降，其与病变的临床特征相关，且与TSH呈负相关。miR-215-5p 的表达可能与预后有关。