刘 芳，刘伟存，彭延波

1.唐山市丰润区人民医院,河北064000；2.唐山工人医院；3.华北理工大学附属医院

抑郁症作为一种情感障碍类精神疾病，生理、心理、社会环境等多种因素均可诱发，发病率逐年增高，治愈率低，复发率高，病人多伴有自杀倾向。据报道，全球范围内抑郁症发病率约为3%，其中30%病人出现过自杀行为，约10%的病人自杀身亡[1-2]。研究发现，海马结构的异常和病变严重影响了抑郁症的发展进程。临床观察显示，同正常人比较，抑郁症病人的海马体积较小，并且神经元细胞出现萎缩、丢失；除此之外，在动物模型中发现海马神经元出现变性、凋亡和坏死的情况。因此，海马区神经元的异常可能是抑郁症形成、发展的重要病理学基础。海马在神经系统的可塑性、学习/记忆以及情感等高级认知功能中发挥重要作用。法舒地尔是一种Rho 激酶（Rho kinase,ROCK）抑制剂，主要应用于临床研究。其主要作用有扩张血管，抑制炎细胞的浸润和炎性介质的释放，促进一氧化氮的形成，抑制纤维化形成，改善组织重构[3-5]。近年来临床研究发现，银杏酮酯和法舒地尔联合应用，能够有效缓解脑卒中后焦虑、抑郁障碍[6]。动物实验也显示，法舒地尔能够有效抑制慢性束缚应激导致的抑郁样行为，避免大鼠海马神经元细胞树突的减少。因此，本研究拟通过慢性不可预见性温和应激（chronic unexpected mild stress，CUMS）法构建大鼠抑郁模型，观察其抑郁样行为的表现和海马区神经组织学改变，并予以法舒地尔预处理，以研究海马神经组织学改变与抑郁样行为的关系和法舒地尔拮抗抑郁的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物与主要仪器 5 周龄大鼠购于北京华阜康生物科技有限公司（SCXK 京2009−0004）的SPF 级雌性SD 大鼠30 只，体重140～160 g；规格为2 mL/30 mg 的盐酸法舒地尔注射液（天津红日药业股份有限公司）；旷场反应箱和数据自动采集及处理系统（安来软件科技有限公司）；Morris 水迷宫及视频分析系统，购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司。盐酸法舒地尔注射液（规格：2 mL，每支30 mg，天津红日药业股份有限公司）；旷场反应箱和数据自动采集及处理系统为安来软件科技有限公司产品；Morris 水迷宫及视频分析系统，购自北京智鼠多宝生物科技有限责任公司。

1.2 CUMS 动物模型制备 5 周龄雌性SD 大鼠30 只适应性饲养1 周，随机分为CUMS 模型组、法舒地尔干预组和对照组，每组10 只。CUMS 模型组：每天接受以下11 种应激中的1 种刺激：潮湿垫料24 h；行为束缚24 h；鼠笼45°倾斜放置24 h；禁水或禁食24 h；4 ℃冰水或42 ℃热水游泳5 min；电击双耳（0.8 mA）2 次，每次5 s；夹鼠尾持续1 min；晃动鼠笼持续15 min；照明持续24 h。同种刺激不连续出现，共计2 轮22 d；并在CUMS 前4 d 开始，腹腔注射生理盐水0.2 mL/d，至实验结束（第22 天）。法舒地尔干预组：在CUMS 前4 d开始，每天腹腔注射法舒地尔0.2 mL（30 mg/kg），持续至实验结束（第22 天）。对照组：每天抓取1 次处理，在CUMS 前4 d 开始，腹腔注射生理盐水0.2 mL/d，至实验结束（第22 天）。

1.3 效果观察

1.3.1 糖水偏好实验 各组大鼠实行禁食和禁水24 h，所有大鼠均单独饲养，每笼放置同样的饮水瓶2 个，一个瓶中盛浓度为1%蔗糖水，另一个盛纯净水，每瓶200 mL，检测1 h 内糖水/纯净水消耗。

1.3.2 旷场试验 旷场试验分析系统主要是通过观察实验动物在新异环境中的自主行为，进而探究动物的行为与紧张度。所有大鼠均先安置在旷场中心部位，以便进一步观察记录大鼠的行进距离（m）、中央格活动时间（s）、站立次数和修饰行为（次数）。

1.3.3 Morris 水迷宫实验 Morris 水迷宫是一个规格为170 cm×50 cm 的圆形水池，其壁内为黑色，内设直径12 cm，高29 cm 的安全岛，圆形水池周围环绕2 m的遮光布帘。每次实验前大鼠适应环境2 h，将安全岛加水至线上10 cm，并随机放置于水迷宫中4 个象限中的任何一个，温度控制在22～25 ℃。每日固定时间、每只大鼠从不同象限进行游泳训练，120 s 内没有找到安全岛，将其放在平台上停留10 s，然后进行下次训练，连续训练4 d，以大鼠均能够在大致相同时间内找到安全岛视为训练成功。在造模前后连续测试3 d，每天测试6 次，记录其下水后找到平台的时间（s），即逃避潜伏期，取3 d 的测试成绩作为其空间记忆成绩。并记录大鼠在水迷宫中行走总路程。

1.3.4 海马区神经组织形态学检测 实验结束，通过腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，剪开腹部，暴露心脏。通过将加满生理盐水的灌注针自左心室插入主动脉，同时剪开右心耳，进行左心体循环灌注，在灌注150 mL生理盐水的基础上，再向其中灌注4%多聚甲醛150 mL进行内固定。冠状面取材，将小脑切下，自视交叉后间隔1 mm 连续取材，固定于4%多聚甲醛中。常规石蜡包埋，8 μm 连续切片。HE 染色，中性树胶封片，光镜观察海马组织形态学变化。

1.4 统计学分析 采用SPSS 13.0 统计分析软件进行统计学分析，定量资料以均数±标准差（±s）表示。3 组间采用单因素方差分析，LSD 检验进行两两比较，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 法舒地尔对CUMS 大鼠糖水偏好行为的影响 CUMS 后，CUMS 模型组大鼠的糖水消耗量、糖水偏好率均低于对照组（P＜0.05），而法舒地尔干预组大鼠的糖水消耗量、糖水偏好率均高于CUMS 模型组（P＜0.05），见表1。

表1 CUMS 应激前后3 组大鼠纯净水消耗量、糖水消耗量、糖水偏好率比较

2.2 法舒地尔对CUMS 大鼠旷场试验行为的影响 CUMS 前，对3 组大鼠进行旷场试验基线水平测定，各组大鼠在行进距离、中央格活动时间、站立次数和修饰行为比较差异均无统计学意义，CUMS 后，CUMS 组大鼠的行进距离、中央格活动时间、站立次数、修饰行为均低于对照组（P＜0.05），法舒地尔干预组大鼠的行进距离、中央格活动时间、站立次数、修饰行为均高于CUMS 组（P＜0.05）。见表2。

表2 CUMS 前后大鼠旷场试验结果

2.3 法舒地尔对CUMS 大鼠水迷宫行为的影响 水迷宫结果显示，CUMS 前3 组逃避潜伏期比较差异无统计学意义（P＞0.05）。CUMS 后，CUMS 模型组大鼠的逃避潜伏期较对照组延长（P＜0.05），而法舒地尔干预组的逃避潜伏期较CUMS 模型组缩短（P＜0.05），与对照组接近。见表3。图1 示法舒地尔对大鼠水迷宫中行走总路程的影响，与对照组比较，CUMS模型组大鼠的平均行走总路程明显延长（P＜0.05），而法舒地尔干预组大鼠的平均行走总路程与对照组相似，较CUMS 模型组明显缩短（P＜0.05）。

表3 法舒地尔对CUMS 大鼠水迷宫逃避潜伏期的影响 单位：s

2.4 法舒地尔对CUMS 模型海马区神经形态学的影响 如图2 所示，对照组海马区域细胞排列整齐，密度较大，锥体细胞层数较多，胞体丰满含较多突起。CUMS 组细胞排列不齐、疏松，锥体细胞层数变少，细胞收缩，突起减少。法舒地尔干预组海马区域神经细胞较CUMS 组有所改善。

图1 法舒地尔对大鼠水迷宫中行走总路程的影响

图2 大鼠海马区神经形态学变化（HE 染色）

3 讨论

大鼠抑郁模型的造模方法主要包括环境刺激（CUMS、悬尾试验、强迫游泳等）、社会刺激（母仔分离、孤养模型）、药物诱导（地塞米松、糖皮质激素、利血平、精神兴奋剂戒断模型、育亨宾、5-羟色胺酸和苯丙胺等）、手术制备（嗅球切除、脊髓横断、脑卒中后抑郁模型）、产后抑郁模型等。其中药物诱导、手术制备、产后抑郁属于有明显的诱导因素，其抑郁形成机制较为简单，适合进行抗抑郁药物的筛选，或属于特定的抑郁模型。然而，抑郁与应激关系密切，CUMS 因能够模仿人类抑郁行为而被广泛应用。模型中的应激因子多具有不可预见性和多变性，同时没有一种应激条件是抑郁行为的决定因素，在刺激因素、发生机制和抑郁样表现方面，与人类实际生活中的长期低水平慢性应激事件较为相符[7-9]。本研究采用了CUMS 大鼠抑郁模型，结果显示，采用CUMS 的20 只大鼠无死亡，经糖水消耗实验、旷场试验和水迷宫实验表明，均伴有不同程度的抑郁样行为，证明大鼠造模成功。本研究观察到，CUMS 模型组大鼠糖水消耗量显著减少，提示对奖赏反应性下降，快感缺失；旷场试验中CUMS 大鼠的行进距离、中央格活动时间、站立次数和修饰行为均较对照组明显减少，这些低探索行为反映了大鼠的抑郁情绪[10-13]。海 马 结 构 包 括 海 马 回（CA1、CA2、CA3 和CA4，主要由锥体神经元）、齿状回（颗粒神经元）、脑小角等部位组成，位于内侧额叶的皮质表层底部，是大脑边缘系统的重要组成部分，在神经系统的可塑性、学习/记忆以及情感等高级认知功能方面起到了关键的调节作用。临床研究显示，抑郁病人的杏仁核、海马体积较正常人小，同时病程与海马体积呈负相关[14]。重度抑郁症病人海马齿状回神经元细胞、神经胶质数目减少，增殖性指标Ki-67 阳性数目减少，提示伴有神经细胞的增殖受限[15]。提示抑郁症发生与海马神经细胞的结构受损、数目减少、再生障碍关系密切。本研究结果表明，CUMS 模型组大鼠逃避潜伏期延长，学习记忆能力下降，提示可能与海马结构异常有关。本研究结果也显示，对照组海马区域细胞排列整齐，密度较大，锥体细胞层数较多，胞体丰满含较多突起。而CUMS 模型组细胞排列不齐、疏松，锥体细胞层数变少，细胞收缩，突起减少。说明CUMS 所导致的海马神经结构异常可能是其抑郁样行为的重要病理学基础之一。

4 小结

CUMS 大鼠出现抑郁样行为，表现在糖水消耗量减少,行进距离、中央格活动时间、站立次数和修饰行为均较对照组明显减少，逃避潜伏期延长，学习记忆能力下降。CUMS 大鼠海马区细胞发生病理改变，给予CUMS 大鼠法舒地尔处理，能够改善海马区细胞发生病理改变，减轻CUMS 大鼠的抑郁样行为。