王爱仙，王怡暄，张闽春，叶丽云，刘新锐，刘福阳，赵俊敏，巫仁高，黄志龙，吴小平**

（1.福建省南平市农业科学研究所，福建 南平 354200；2.福建省武夷山市农业局食用菌站，福建 武夷山 354300；3.福建农林大学菌物研究中心，福建 福州 350002；4.福建省食用菌技术推广总站，福建 福州 350000）

灵芝 [Ganoderma lucidum(Lesyss ex Fr.)Karst]，隶属于真菌门（Eumycota）担子菌亚门（Basidiomycotina） 层菌纲 （Hymenomycetes） 非褶菌目 （A-phyllophorales） 灵芝菌科 （Ganodermataceae） 灵芝属（Ganoderma），又名神草、瑞草、神芝和万年蕈等[1]，有着悠久的历史，是中国中医药宝库中的一颗璀璨明珠。据统计，2018年我国灵芝产量达到16.8万吨，比2017年产量增加22.13%，是世界上灵芝的主要生产和出口国[2]。灵芝含有丰富的生物活性物质，如多糖、三萜、氨基酸、维生素、生物碱、甾醇类物质等[3]，而多糖和三萜是其中的主要药效成分，其含量可作为衡量灵芝质量的标准[4]。灵芝多糖具有降“三高”、抗癌、抗氧化、提高免疫力和增强体质等功能[5-8]；灵芝三萜具有保肝排毒、降低胆固醇、调节血脂、抑制肿瘤细胞、抗HIV病毒和抗炎等活性[9-10]。木屑与棉籽壳是灵芝栽培常用的主要原料，为探索木屑与棉籽壳的最优配比的栽培配方，研究从灵芝子实体的产量、净收益、多糖含量、三萜含量和水提物抗氧化活性等指标进行综合分析，从而筛选出综合指标好的优良配方，为灵芝产业的发展提供积极的促进作用。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

灵芝菌株T01由福建农林大学菌物研究中心提供。

1.2 出菇栽培

选用18 cm×35 cm聚乙烯塑料袋，不同灵芝栽培配方各辅料配比见表1。

表1 不同灵芝栽培配方各辅料配比Tab.1 Proportion of excipients in different Ganoderma lucidum cultivation formula

按照表1中的配方拌料装袋，含水量60%，其中配方1为灵芝栽培常规配方，作为对照。每袋装湿料1.25 kg，每个配方120袋，采用常规常压灭菌，冷却后在接种箱中接入原种，25℃黑暗培养菌丝，待菌丝满袋完成后熟后移到出菇房开袋出芝。将菇房分为3区，每区每个配方40袋。设置出菇温度为26℃～28℃，空气湿度为85%～90%。当灵芝芝盖边缘白色或黄色生长圈消失转为棕褐色，菌盖开始革质化，菌管层出红褐色孢子时进行采收，记录每区每个配方采收灵芝鲜重。将新鲜灵芝放入60℃烘箱中烘干备用。

1.3 检测方法

1.3.1 多糖提取与检测

灵芝多糖采用热水浸提法进行提取[11]。准确称取2 g灵芝子实体粉末，加20 mL蒸馏水90℃水浴2 h，6 000 r·min-1离心收集5 mL上清液。在样品中加10 mL蒸馏水再重复提取1次，合并2次的提取液10 mL，加入3倍体积的无水乙醇进行醇沉过夜。5 000 r·min-1下离心10 min，弃去上清液，所得沉淀用蒸馏水溶解并定容至50 mL。多糖检测采用苯酚硫酸法[12]，每组3个重复。

1.3.2 三萜提取与检测

灵芝三萜的提取参考叶丽云的方法[13]。准确称取2 g灵芝子实体粉末于100 mL三角瓶中，加入85%乙醇30 mL常温浸提2 h后，超声提取0.5 h。重复提取1次，合并2次提取液，用滤纸过滤收集滤液，用旋转蒸发仪60℃减压蒸馏去除滤液中的乙醇，最后用甲醇定容至50 mL，每组3个重复。灵芝三萜含量采用香草醛-冰醋酸法检测[14]，三萜图谱相似度采用高效液相色谱法（HPLC）进行检测[15]。

1.3.3 灵芝水提物抗氧化活性的检测

参照蔡梦婷等[16]方法对灵芝进行抗氧化活性研究。准确称取2 g灵芝子实体粉末，加20 mL蒸馏水90℃水浴2 h，6 000 r·min-1离心收集的上清液即为灵芝水提物。

DPPH自由基清除率的测定：吸取2.0 mL样品溶液，加入2.0 mL的0.2 mmol·L-1DPPH溶液中，充分混匀后25℃避光反应30 min，于517 nm处测定吸光值。设3个平行，求平均值。计算样品对DPPH自由基的清除率（W，%），公式为：

式中：Aj空白组为以无水乙醇替代样品的反应体系的吸光值；Ai样品组为添加样品的反应体系的吸光值；A0对照组为以无水乙醇替代DPPH的反应体系的吸光值。

ABTS自由基清除率的测定：准确配制7.0 mmol·L-1ABTS 溶液及 2.45 mmol·L-1过硫酸钾水溶液，充分混匀，25℃避光静置12 h～16 h后，即得ABTS+母液。将ABTS+母液用去离子水稀释，使其在734 nm处的吸光值为0.70±0.023，并于30℃平衡30 min后，即得ABTS+工作液。吸取2.0 mL样品溶液加入2.0 mLABTS+工作液，混匀后25℃避光放置20 min，于734 nm处测定吸光值。设3个平行，求平均值。计算样品对ABTS自由基的清除率（M，%），公式为：

式中：A2空白组为以去离子水替代样品的反应体系的吸光值；A1样品组为添加样品的反应体系的吸光值；A0对照组为以去离子水替代ABTS的反应体系的吸光值。

1.4 数据处理

数据分析采用Excel 2003和SPSS 19.0软件。单袋产量以3个区的单袋产量的平均值表示。多糖、三萜和抗氧化活性样品从每个区的40个重复中随机选取3个，结果以x±σ表示。HPLC相似度分析利用软件的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版。

2 结果与分析

2.1 不同配方对灵芝产量的影响

不同栽培配方对灵芝产量的影响见图1。

图1 不同配方栽培灵芝单袋产量Fig.1 Single bag yield of Ganoderma lucidum cultivated in different formulas

如图1所示，以木屑为主的常规栽培配方1为对照，配方2、配方3、配方4、配方5的单袋产量得到显著提高（P＜0.05），说明在辅料中加入棉籽壳有助于提高灵芝的产量。其中，配方3、配方4、配方5的产量与对照配方1相比达到极显著水平（P＜0.01)，配方3、配方5单袋产量较高，分别比对照配方提高了33.49%、30.01%，其次是配方4，比对照配方提高了19.97%，说明同时用棉籽壳和木屑作为碳源栽培灵芝可显著提高产量，且当木屑与棉籽壳比为1∶1时效果最好。

2.2 不同配方对灵芝多糖与三萜含量的影响

不同栽培配方对灵芝子实体多糖和三萜含量的影响见表2。

表2 不同配方栽培灵芝子实体中多糖和三萜含量比较Tab.2 Contents of polysaccharides and triterpenoids in fruiting bodies of Ganoderma lucidum cultivated in different formulas

由表2所示，各配方中，配方2多糖含量为5.72 mg·g-1，极显著高于对照配方 （P＜0.01），配方3、配方4、配方5之间多糖含量差异不显著，约为（3.385±0.125） mg·g-1，且都极显著低于对照配方1（4.61 mg·g-1，P＜0.01），说明在辅料中加入棉籽壳能有效提高灵芝子实体中多糖含量，但同时用棉籽壳和木屑不利于子实体多糖的积累。在三萜方面，配方4三萜含量是对照配方1的1.24倍。配方2、配方3三萜含量与对照配方相近，配方5三萜含量最低为4.90 mg·g-1。不同配方栽培灵芝子实体三萜高效液相图谱见图2，其图谱相似度见表3。

由图2、表3所示，利用高效液相检测法所提取的三萜中灵芝酸的差异发现，不同配方灵芝酸图谱相似度高，均在97%以上。由此可见，不同配方不改变三萜中灵芝酸种类。

表3 不同配方栽培灵芝子实体三萜高效液相图谱相似度Tab.3 Similarity of triterpenoids in fruiting body of Ganoderma lucidum in different formulas

图2 不同配方栽培灵芝子实体三萜高效液相图谱Fig.2 High chromatogram of triterpenes from fruiting body of cultivated Ganoderma lucidum with different formulas

2.3 不同配方对灵芝水提物抗氧化活性的影响

以DPPH、ABTS自由基清除率为指标，检测不同配方栽培灵芝水提物抗氧化活性，结果见表4。

表4 不同配方栽培灵芝水提物对DPPH与ABTS自由基清除率Tab.4 DPPH and ABTS free radical scavenging rates of water extracts from Ganoderma lucidum cultivated in different formulas

由表4可知，不同配方栽培灵芝水提物均能一定程度消除自由基，其中在DPPH自由基清除率方面，配方2、配方4、配方5栽培的灵芝子实体抗氧化活性之间差异不显著，但都显著优于对照配方1（P＜0.05）。在ABTS自由基清除率方面，配方3、配方4、配方5栽培的灵芝子实体抗氧化活性与对照相比相近，无显著差异，而配方2对ABTS自由基清除活性最差为86.45%，显著低于配方3、配方4。

3 讨论与结论

灵芝是我国重要的药用真菌，其药理作用与灵芝次级代谢产物多糖和三萜等活性成分紧密相关。近年来研究表明生物体氧化代谢不断产生的自由基，紧密参与生物机体老化与病变的发生过程，而灵芝提取物能一定程度上消除自由基。殳叶婷等[17]从鉴定分析、体外细胞、体内动物试验等多个角度验证，灵芝多糖可以清除过多的自由基，抑制脂质过氧化，提高细胞活力从而对抗氧化损伤；蔡梦婷等[16]研究灵芝孢子、子实体和菌丝体的抗氧化活性比较，发现菌丝体过氧化氢清除能力明显优于子实体和孢子，且活性部位主要集中在水提液醇沉分离的上清液；陈杰等[18]研究发现同种灵芝在不同产地的子实体其水提物对DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基的清除能力不同。本研究中的灵芝抗氧化活性比较分析中，不同木屑和棉籽壳的配比，其灵芝子实体的水提物均能消除部分自由基，但消除程度不同，配方5、配方2和配方4的DPPH自由基清除率显著高于以木屑为主的常规栽培对照配方，配方3和配方4的ABTS自由基清除率显著高于配方2。

灵芝是我国最早人工栽培的大型真菌，迄今已经有2 000多年的栽培历史[19]。人工栽培灵芝的方法可分为椴木栽培和代料栽培，代料栽培的主要原料有木屑、棉籽壳、玉米芯、甘蔗渣等。本研究选用灵芝栽培最常用的木屑和棉籽壳，设置不同的配比，结果表明，用木屑和棉籽壳作为辅助原料栽培灵芝可提高产量，且当木屑与棉籽壳比为1∶1时效果最好。在辅料中加入棉籽壳能有效提高灵芝子实体中多糖含量，但同时用棉籽壳和木屑不利于子实体多糖的积累，不同配方不改变三萜中灵芝酸种类。从产量、品质（多糖含量、三萜含量和水提物抗氧化活性等指标） 综合分析，得出配方4（木屑52%、棉籽壳26%、麦麸13%、玉米粉7%、蔗糖1%、石膏1%）是最佳的灵芝栽培配方。