周 勇, 朴秀英, 廖先骏, 刘 佳, 朱 航, 马海昊, 周小毛*,, 李富根*,

(1. 湖南省农业科学院 湖南省农业生物技术研究所，长沙 410125；2. 农业农村部农药检定所，北京 100125)

腐霉利 (procymidone，结构式见式1)是20 世纪80 年代开始在中国投入使用的1 种二甲酰亚胺类内吸性杀菌剂，主要通过抑制菌体内甘油三酯的合成来抑制葡萄孢属和核盘菌属真菌，兼具保护和治疗双重作用，低毒、廉价、高效且具有广谱杀菌性，目前仍是防治韭菜灰霉病的主要药剂之一[1-3]。

灰霉病是韭菜上的常见病害，会严重降低其产量和品质[4]，目前主要的防治手段仍为化学药剂防治，但长期使用或不合理用药易导致韭菜中农药残留量超标的问题[5]。韭菜基质较为复杂，色素含量高且含有挥发性含硫化合物，尤其冷冻后的韭菜较难通过微波消除巯基，因此检测难度较大[6]。

目前关于腐霉利残留的研究报道较多，所用分析方法主要有气相色谱法和气相色谱-质谱联用法[7-13]等，但这些方法主要采用固相萃取柱对样品进行净化，过程繁琐且成本较高，因此建立新的高效、简便的分析方法将有助于韭菜中腐霉利残留检测工作的开展。

液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 具有灵敏度高、操作简便等优点，但关于采用LC-MS/MS 法检测韭菜中腐霉利残留量并进行膳食暴露评估方面的研究目前尚未见报道。本研究采用QuEChERS前处理结合高效液相色谱-串联质谱仪 (HPLC-MS/MS)，建立了韭菜中腐霉利残留的分析方法，据此对中国8 个省份试验点田间规范残留试验的韭菜样品进行了检测，并与目前中国制定的韭菜中腐霉利最大残留限量 (MRL) 标准 (0.2 mg/kg)[14]进行比较，对腐霉利的残留超标风险进行了验证。

张旭晟等[13]通过抽查市售韭菜得到残留监测数据，结合上海市居民食物消费量调查结果，基于蒙特卡罗分析法及相关计算方法，进行了韭菜中腐霉利残留的膳食暴露风险评估，提出了应合理调整韭菜中腐霉利MRL 标准的建议。本研究拟通过田间规范残留试验得到腐霉利在韭菜上使用后的残留量数据，结合中国居民人均膳食结构调查数据，对腐霉利在韭菜上使用后的长期膳食暴露风险进行评估，并结合残留量超标风险验证结果，就目前韭菜中腐霉利MRL 标准的合理性进行评价，以期为腐霉利在韭菜生产上的合理使用提供建议。

1 材料与方法

1.1 仪器、药剂及试剂

TSQ Endura 三重四极杆高效液相色谱-串联质谱联用仪 (HPLC-MS/MS，赛默飞世尔科技公司)；Hypersil GOLD C18色谱柱 (2.1 mm × 100 mm，1.9 μm)；Blixer 6 V.V. 乳化搅拌机 (法国ROBOTCOUPE 公司)；TG16-Ⅱ高速离心机及TDZ5-WS低速离心机 (湖南平凡科技有限公司) ；ME104E 1/10 000 电子天平 (梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；JY5002 1/100 电子天平 (上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；MTV-100 多管旋涡混合仪 (杭州奥盛仪器有限公司)；DHG-9030A 电热鼓风干燥箱 (中仪国科北京科技有限公司)；XW-80A 微型漩涡混合仪 (上海沪西分析仪器有限公司)。

99.9%腐霉利 (procymidone) 标准品 (天津阿尔塔科技有限公司)；50% 腐霉利可湿性粉剂(WP) (陕西亿农高科药业有限公司)。试剂乙腈、氯化钠为分析纯，甲醇、甲酸为色谱纯；石墨化碳黑 (GCB) 及N-丙基乙二胺 (PSA) (上海安谱实验科技股份有限公司)；超纯水 (广州屈臣氏食品有限公司)。

1.2 田间试验

根据NY/T 788―2018《农作物中农药残留试验准则》[15]，于2019 年分别在黑龙江 (露地)、辽宁 (大棚)、河南 (大棚)、山东 (露地)、安徽 (露地)、湖南 (大棚)、广西 (露地) 及福建 (大棚) 8 地开展腐霉利在韭菜中的规范残留试验。每个试验点分别设1 个处理小区和1 个对照小区，每个小区面积不小于50 m2，小区之间设置隔离带。以喷清水的处理为空白对照。

50% 腐霉利WP 按推荐最高剂量 (有效成分450 g/hm2，制剂量900 g/ hm2)，用清水溶解、稀释后喷雾。于韭菜灰霉病发病初期或前期施药1 次，分别于施药后2 h 及10、20、30、40 d 采集韭菜样品。按对角线法采样，切碎并充分混匀后四分法留样150 g，于 -18 ℃以下条件保存，备用。

1.3 分析方法

1.3.1 样品提取 准确称取10.0 g 匀浆后的韭菜样品于100 mL离心管中，加入40 mL 乙腈，涡旋混合1 min；加入5.0 g 氯化钠，继续涡旋混合1 min；在4 000 r/min 条件下离心3 min，取10 mL上清液于35 ℃下旋蒸至近干后，用1 mL 乙腈润洗，待净化。

1.3.2 样品净化 取1 mL 上述提取液于装有20 mg GCB 和40 mg PSA 的离心管中，漩涡混匀，在10 000 r/min 条件下离心3 min，取上清液过0.22 μm 微孔滤膜，待检测。

1.3.3 仪器检测条件

色谱条件：Hypersil GOLD C18色谱柱 (2.1 mm ×100 mm，1.9 μm)；柱温35 ℃；进样量5 μL；流动相A 为甲醇溶液，流动相B 为0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱条件见表1 (流动相A 和B 的比例均为体积比)。

质谱条件：多离子反应监测 (MRM) 模式扫描，ESI+电离模式；离子喷雾电压3 500 V；离子传输管温度320 ℃；喷针温度300 ℃；雾化气为氮气，压力：中鞘气 275 kPa，辅助气 69 kPa，反吹气6.9 kPa；碰撞气为氩气，压力0.002 kPa；射频透镜电压140 V；定量离子对 (m/z)：284.2-256.0，碰撞能24 V；定性离子对 (m/z)：284.2-95.0，碰撞能16 V。在选定的条件下，腐霉利保留时间为3 .92 min。

表1 梯度洗脱条件Table1 Gradient elution conditions

1.3.4 标准溶液配制及标准曲线绘制

这一点在孟子对舜与象的关系建构中也能够得到印证[注]①与“瞽叟杀人”的“亲亲相隐”问题不同，此处的“受害者”为舜本人。因而此处的首要问题是对于暴力的认识，而非血缘亲情与法律的冲突。：“万章问曰：‘象日以杀舜为事，立为天子，则放之，何也？’孟子曰：‘封之也，或曰放焉。’”[4](P305)孟子与万章师生此处的讨论，显然是以承认“象至不仁”“日以杀舜为事”这一事实为前提的，然而即使面对杀身之祸，孟子仍勉力于维护舜至善而全能的形象，“仁人之于弟也……亲爱之而已矣”，而与基本人性本能、孟子自身强调的“舍生取义”等相冲突而显得十分生硬、无奈。

标准溶液配制：准确称取0.050 7 g 腐霉利标准品，用甲醇溶解并定容至5 0 m L，配成1 000 mg/L 的标准品母液。用甲醇将标准品母液逐级稀释，配成100 和10 mg/L 的标准溶液，试验时再将10 mg/L 的标准溶液用甲醇稀释，配成5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1 和0.05 mg/L的系列标准工作溶液。

基质匹配标准工作溶液配制：按照1.3.1 节和1.3.2 节的方法将空白韭菜样品进行提取净化后得到空白基质溶液，再用空白基质溶液将100 mg/L的腐霉利标准溶液逐级稀释，配成5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1 和0.05 mg/L 的系列基质匹配标准工作溶液。

标准曲线绘制：按照1.3.3 节条件对标准工作溶液和基质匹配标准工作溶液进行检测，每浓度重复测定3 次，采用外标法定量。以进样质量浓度为横坐标、对应的峰面积为纵坐标，分别绘制腐霉利的溶剂标准曲线和基质匹配标准曲线。

1.3.5 添加回收试验 向韭菜空白样品中分别添加0.02、0.2、2.0 和20 mg/kg 4 个水平的腐霉利标准工作溶液，每个水平重复5 次。振荡混匀并静置30 min 后，按照1.3.1 节和1.3.2 节的方法进行提取净化，按1.3.3 节的条件进行分析 (其中添加水平为20 mg/kg 的样品用乙腈稀释10 倍后再进样测定)，计算添加回收率和相对标准偏差。

1.4 韭菜中腐霉利残留的长期膳食暴露评估

根据规范残留试验中值 (STMR/STMR-P) 或MRL 值，按公式 (1) 计算农药的国家估算每日摄入量，按公式 (2) 计算风险商[16-18]。

公式 (1) 中：NEDI (national estimated daily intake) 为国家估算每日摄入量，mg；STMRi(supervised trials median residue) 指农药在某一食品中的规范残留试验中值，mg/kg；STMR-Pi指用加工因子校正后的规范残留试验中值；Fi指一般人群对某种食品的消费量。计算时，若没有合适的STMR 或STME-Pi值，也可使用所制定的MRL值代替[17]。公式 (2) 中：bw 为体重，中国一般人群的人均体重按63 kg 计算；RQ (risk quotient) 为风险商；ADI (acceptable daily intake) 为每1 kg 体重每日允许摄入的农药量，mg/kg (bw)。当RQ ≤1 时，可认为该农药残留量不会对一般人群健康产生不可接受的风险，RQ 越小，表示风险越低，并可在此基础上推荐其MRL 标准[17]。

2 结果与分析

2.1 方法的线性范围

2.2 基质效应

为提高检测准确度，本研究采用基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线斜率的比值 (k) 评价基质效应的强弱[19]：k 值越接近1，表明基质效应越小；k ＞1 时为增强效应；k ＜1 时为减弱效应。根据表2中线性方程斜率之比，计算得到本研究中的k 值为0.86，为基质减弱效应。

表2 腐霉利的线性方程、决定系数和定量限Table2 Linear equations, R2 and LOQs of procymidone

2.3 方法的准确度和精密度

添加回收试验结果 (表3) 表明，所建立的方法准确度和精密度良好，符合农药残留检测要求[15]。韭菜空白样品及添加样品色谱图见图1，以最小添加水平作为方法的定量限 (LOQ)，则可得腐霉利在韭菜中的LOQ 为0.02 mg/kg，具有较高的灵敏度。

表3 腐霉利在韭菜中的添加回收率及相对标准偏差 (n = 5)Table3 The recoveries and relative standard deviation of procymidone in Chinese chives (n = 5)

2.4 腐霉利在韭菜中的最终残留量

50%腐霉利WP 按有效成分450 g/hm2的剂量，于韭菜灰霉病叶片发病初期或发病前期喷雾施药1 次，结果 (表4) 表明：腐霉利在韭菜中的残留量随时间推移而逐渐降低，施药后间隔30 d和40 d 所采样品中，腐霉利的残留中值分别为0.19和0.13 mg/kg。比较8 个地区试验点的残留结果发现，露地栽培韭菜中腐霉利的原始沉积量总体大于大棚，其原因可能是由于露地的开放式环境使得作物叶面较为干燥，易于药液的吸收与富集，而大棚环境湿度较大，不利于药液的吸收和富集。

2.5 长期膳食暴露风险

农药的膳食暴露风险由其在农产品中的最终残留量、ADI 值及膳食摄入量等因素共同决定。腐霉利的ADI 值为0.1 mg/kg (bw)[14]；膳食消费量数据来源于中国居民人均膳食结构调查结果[20]，由于目前无对应登记作物的单独膳食量数据，因此采用分组蔬菜和整体水果的膳食量数据进行长期暴露评估；本研究得到的韭菜中腐霉利残留中值为0.18 mg/kg，遵循风险最大化原则，选取同属于深色蔬菜且具有更高残留中值的油麦菜进行计算 (本研究长期膳食暴露评估中油菜籽、叶用莴苣、油麦菜及青蒜的残留中值数据均来源于第二届国家农药残留标准审评委员会第八次会议)，其他作物取MRL 值进行计算，因此本研究的长期膳食暴露评估是结合了残留试验中值和MRL 值的混合评估结果，以供参考。表5 中结果表明，腐霉利的国家估算每日摄入量 (NEDI) 为2.556 2 mg，一般人群对腐霉利的长期膳食暴露风险商为40.6%，小于1，表明腐霉利按推荐剂量和推荐安全间隔期在韭菜上施用，不会对一般人群的健康产生不可接受的风险。

表4 腐霉利在韭菜中的最终残留量Table4 The terminal residues of procymidone in Chinese chives

表5 腐霉利长期膳食暴露风险评估结果Table5 Chronic dietary exposure risk assessment results of procymidone

3 结论与讨论

本研究建立了简便、高效、稳定的韭菜中腐霉利残留量检测方法，采用QuEChERS 方法进行前处理，样品经乙腈提取，GCB 和PSA 净化，HPLC-MS/MS 检测。在0.02～20 mg/kg 添加水平下，腐霉利在韭菜中的回收率为74%～98%，RSD 为4.6%～9.9%，符合农药残留分析要求[15]。

目前中国在韭菜上登记使用的腐霉利制剂有15%腐霉利烟剂 (SG) 和50%腐霉利可湿性粉剂(WP)，前者用于保护地，后者用于保护地和露地，相比之下，后者的应用场所更广。刘敏艳等[21]采用有效成分剂量相同的百菌清 (chlorothalonil)SG 和WP 在大棚黄瓜上进行对比试验，施药1 d后，SG 组的原始沉积量仅为WP 组的3.8%，施药后2、3、5、7 d，SG 组的消解率均大于WP组，表明与WP 相比，SG 的原始沉积量相对较低且消解速度较快，因此施用烟剂的残留风险相对较低。考虑到风险最大化原则，本研究选择50%腐霉利WP 进行田间残留试验。结果表明，按推荐最高剂量(有效成分450 g/hm2，制剂量900 g/hm2)于韭菜灰霉病发病初期或前期施药1 次，腐霉利在韭菜中的残留量随时间推移而逐渐降低，施药30 d 后，其最终残留量在0.04～0.96 mg/kg 之间，超出目前韭菜中腐霉利的MRL 标准 (0.2 mg/kg)[14]，因此存在一定的残留超标风险。

近年来关于韭菜中腐霉利残留超标的问题时有发生。吕冰峰等[22]对2018 年国家食品安全监督抽检中蔬菜的抽检结果进行分析后发现，韭菜不合格的原因主要是腐霉利残留量超标。张旭晟等[13]对2016 至2018 年间上海市市售韭菜中腐霉利的残留情况及居民膳食暴露风险进行了评估，得出韭菜中腐霉利的膳食暴露风险较低，并提出了应进一步收集数据完善风险评估结果，以及合理调整韭菜中腐霉利MRL 标准的建议。本研究结合腐霉利在中国的登记使用情况、田间规范残留试验结果和居民人均膳食结构所进行的风险评估结果也表明，一般人群对腐霉利的膳食暴露风险较低。虽然按照推荐的施药时期、剂量和方法进行施药，严格依照安全间隔期进行采收，韭菜中腐霉利的最终残留量仍存在超标风险，但通过韭菜摄入的腐霉利并不会对一般人群的健康造成不可接受的风险，因此同样也建议应对韭菜中腐霉利的MRL 标准进行合理调整。

本研究针对韭菜中腐霉利残留的长期膳食暴露风险进行了评估，但存在以下不足：1) 由于目前尚无韭菜在1 餐或1 d 内的大份额膳食数据，因此未进行短期膳食暴露评估，导致评估结果不全面。2) 因缺少对应登记作物的单一膳食消费量数据，采用分组蔬菜和整体水果的膳食量数据进行计算，且鲜玉米和草莓的规范残留试验中值用其MRL 值进行替代，由此所得风险评估结果会明显高于实际膳食暴露风险。乔雄梧[23]分析认为，在采用MRL 值代替规范残留试验中值的情况下，所估算的食品中农药残留浓度将提高4 倍以上。由此可见登记作物规范残留试验中值基础数据的完善对膳食风险评估结果的准确性影响较大。相信随着中国农药残留膳食暴露评估工作的广泛开展，有望早日完善食品中农药残留风险评估研究方法和体系，从而得到更为准确、全面的农药残留膳食暴露评估结果。