冯明星, 胡兆农*,,,3, 吴文君

(1. 西北农林科技大学 植物保护学院，陕西 杨凌 712100；2. 陕西省植物源农药研究与开发重点实验室，陕西 杨凌712100；3. 农业农村部西北黄土高原作物有害生物综合治理重点实验室，陕西 杨凌 712100)

21 世纪以来，开发具有高效、低毒、安全系数高、选择性和环境相容性好的新农药已成为农药研发的主要目标，而利用靶标酶设计绿色环保农药已成为农药开发的重要领域[1]。迄今，研究发现作用于昆虫中肠的杀虫活性物质有苏云金杆菌Bacillus thuringiensis (Bt) 毒素蛋白和杀虫植物苦皮藤 Celastrus angulatus 中的苦皮藤素。Bt 作用昆虫中肠肠壁细胞膜上的靶标主要有氨肽酶[2]、碱性磷酸酶[3]、肌动蛋白[4]及一些糖脂[5]，其中氨肽酶和碱性磷酸酶普遍被认为是Bt 毒素蛋白结合的初始靶标，这为后期毒素蛋白插入昆虫中肠细胞膜形成“孔洞”奠定了基础[6]；而苦皮藤素在昆虫体内的作用靶标为V-ATP 酶H 亚基[7-9]。

杀虫植物杠柳Periploca sepium Bunge 为萝藦科 (Asclepiadaceae) 杠柳属蔓生性灌木，其根皮中含有一类杀虫活性成分——杠柳新苷类化合物[10]。前期研究表明，这类化合物主要作用于东方黏虫Mythimna separata Walker 幼虫的中肠肠壁细胞[11-14]，推测杠柳新苷类化合物有可能在昆虫中肠细胞膜上具有类似Bt 毒素蛋白或苦皮藤素的作用靶标[15-16]。此外，根据杠柳新苷类化合物对东方黏虫的作用症状，结合定量差异蛋白组学鉴定的表达差异蛋白功能特性分析，认为V-ATP 酶、氨肽酶、碱性磷酸酶均有可能是杠柳新苷类化合物的疑似作用靶标[17]。本研究在比较6 个杠柳新苷类化合物对3 龄东方黏虫幼虫胃毒毒力基础上，测定了它们对东方黏虫幼虫中肠特征酶V-ATP 酶、氨肽酶和碱性磷酸酶的酶比活力的影响，旨在为进一步研究杠柳新苷类化合物可能的作用靶标及其作用机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 昆虫 东方黏虫Mythimna separata Walker幼虫由西北农林科技大学农药研究所养虫室提供，为小麦或玉米叶片人工累代饲养30 代以上的敏感品系，饲养温度为 (22 ± 1) ℃，相对湿度为60%～70%，光周期为L : D = 16 h : 8 h。

1.1.2 化合物 杠柳新苷A (PSA)、杠柳新苷D(PSD)、杠柳新苷E (PSE)、杠柳新苷F (PSF)、杠柳新苷P (PSP) 和杠柳新苷T (PST)，均由西北农林科技大学农药研究所从杠柳根皮提取物中分离得到，其化学结构式如图式1 所示。经高效液相色谱检测其纯度达98%以上。

1.1.3 供试试剂 Bradford 法蛋白定量测定试剂盒 (PA102) 购于北京天根公司；腺苷三磷酸-三羟甲基氨基甲烷 (Tris-ATP)、原钒酸钠、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸 (HEPES)、碳酸氢钠、2-吗啉乙磺酸 (Mes) 和巴弗洛霉素A1 (Bafilomycin A1,CAS88899-55-2) (纯度 ≥ 95%) 购于Sigma 公司；乙二醇双 (2-氨基乙基醚) 四乙酸 (EGTA)，购于北京索莱宝科技有限公司；MgSO4等无机试剂为国产分析纯，购于广东光华公司；乙醚为分析纯，购于西陇化工；Protease Inhibitor Cocktail (EDTAfree) 购于Roche 公司；Bestatin 购自美国Apexbio 公司；L-亮氨酸-p-硝基苯胺 (Leu-pNA) 购自上海科汇公司。

1.1.4 主要仪器 Sorvall ST16R 冷冻离心机，美国Thermo Scientific 公司；CR22G III 高速冷冻离心机，日本Hitachi 公司；BG25 金属浴，杭州博日科技有限公司；Infinite M 200 Pro 全波长酶标仪，瑞士TECAN 公司；Seven Easy S20 pH 计，瑞士Mettler Toledo 公司。

1.1.5 缓冲液的配制

1.1.5.1 东方黏虫中肠细胞中BBMV 提取纯化所用缓冲溶液 Buffer A：300 mmol/L 甘露醇，5 mmol/L EGTA，17 mmol/L Tris-HCl (pH = 7.5)；1 mmol/L 苯甲基磺酰氟 (PMSF) (现用现配)。

Buffer B：150 mmol/L Mannitol，2.5 mmol/L EGTA，8.5 mmol/L Tris-HCl (pH = 7.5)；1 mmol/L PMSF (现用现配)。

Buffer C：150 mmol/L NaCl，5 mmol/L EGTA，20 mmol/L Tris-HCl (pH = 7.5)，1% 3-[(3-胆固醇氨丙基) 二甲基氨基]-1-丙磺酸 (CHAPS)；1 mmol/L PMSF (现用现配)。

Buffer D：24 mmol/L MgCl2。

1.1.5.2 V-ATP 酶活性测定所用缓冲液 Ringer Solution：25 mmol/L HEPES，150 mmol/L NaCl，3.5 mmol/L KCl，1.8 mmol/L NaHCO3，1.0 mmol/L MgSO4，1.7 mmol/L CaCl2，5 mmol/L葡萄糖，pH = 7.1。

Lysis Buffer-PIC：5 mmol/L Na-HEPES，2 mmol/L EGTA，10 mmol/L 2-巯基乙醇 (Mercapto EtOH), pH ＝ 7.1。

Lysis Buffer + PIC：5 mmol/L Na-HEPES，2 mmol/L EGTA，10 mmol/L Mercapto EtOH，PIC(Protease Inhibitor Cocktail)，pH ＝ 7.1。

PO Buffer：160 mmol/L Tris-Mes，pH = 6.9。

MV Buffer：30 mmol/L MgCl2，0.8 mmol/L原钒酸钠，98 ℃煮沸3 min。

KN Buffer：160 mmol/L KCl，4 mmol/L NaN3(10 × KN：2.6 mg/mL)。

8 mmol/L Tris-ATP：用ddH2O 配制为8 mmol/L，分装后保存于 -20 ℃。

巴弗洛霉素A1 (Bafilomycin A1)：用DMSO稀释至48 μmol/L (阳性对照药剂)。

钼酸钠溶液：将3 份200 mmol/L 的钼酸钠溶液加入到6 份ddH2O 中，然后加入1 份现配的24%硫酸。

孔雀石绿 (Malachite Green)：18.5 mg 孔雀石绿溶于25 mL 1%聚乙烯醇中。

1.1.5.3 氨肽酶活性测定所用缓冲液 反应缓冲液：0.25 mol/L Tris-HCl (pH = 7.8)，26 mol/L NaCl；反应底物：15.96 mg Leu-pNA 溶于1 mL 甲醇 (现配现用)；Bestatin：10 μmol/L Bestatin 溶液 (阳性对照药剂)。

1.2 试验方法

1.2.1 杠柳新苷类化合物的杀虫活性 采用载毒叶片饲喂法[18]测定6 个杠柳新苷类化合物 (PSA、PSD、PSE、PSF、PSP 和PST) 对东方黏虫幼虫的胃毒毒力：挑选蜕皮第2 天的3 龄东方黏虫幼虫，置于培养皿内饥饿12 h 备用。将待测化合物用丙酮分别配制为供试昆虫死亡率在10%～90%范围的系列浓度梯度的溶液。用1 μL微量点滴器将不同浓度的药液分别涂布于0.5 cm × 0.5 cm 小麦或玉米叶片上，以用等量丙酮涂布的处理作为空白对照。待溶剂挥发后，将其置于24 孔板中，每孔放置1 片载毒叶片及1 头饥饿处理的3 龄东方黏虫幼虫。每处理设置20 头试虫，重复3 次。用湿纱布保湿，在22～25 ℃、相对湿度为70%～80% 的养虫室内饲养。不定时观察幼虫中毒症状。采用SPSS20.0 软件 (SPSS Inc., Chicago, USA)统计分析试虫24 h 死亡结果，并计算LC50值。

1.2.2 东方黏虫中肠细胞BBMV 的制备和检测 东方黏虫中肠细胞BBMV 的制备参照MgCl2沉淀差速离心法[19]。挑选蜕皮第2 天的5 龄东方黏虫幼虫，经12 h 饥饿后解剖其中肠。首先，用预冷的质量分数为0.7%的氯化钠溶液将解剖得到的中肠清洗干净，经滤纸吸干水分后称量。将4.5 mL Buffer A 溶液加入500 mg 解剖中肠中，用玻璃匀浆器于冰上进行手动匀浆5 次，每次1 min，两次间隔1 min。随后，加入等体积 (4.5 mL) 24 mmol/L的氯化镁溶液，冰浴15 min 后，于4 ℃、2 500 g下离心15 min，留取上清液 (记为第1 次离心所得) 置于冰上；用4.5 倍体积 (2.25 mL) 的Buffer A 溶液及等体积24 mmol/L 的氯化镁溶液将离心所得沉淀重悬；再次于4 ℃、2 500 g 下离心15 min，取上清液 (记为第2 次离心所得) 置于冰上；用4.5 倍体积 (2.25 mL) 的Buffer A 及等体积24 mmol/L 的氯化镁将第2 次离心所得沉淀再次重悬，冰浴15 min，然后于4 ℃、2 500 g 下再次离心15 min，取上清液 (记为第3 次离心所得) 置于冰上。将3 次离心所得的上清液合并，于4 ℃、30 000 g 下离心30 min；将沉淀重悬于Buffer B 溶液，冰浴4 h，再次于4 ℃、30 000 g 下离心30 min。弃去上清液，沉淀悬于Buffer C 溶液，用于氨肽酶及碱性磷酸酶活测定。

东方黏虫中肠细胞BBMV 的制备质量检测方法：将提取的BBMV 和中肠粗酶液作为反应物，分别测定其中碱性磷酸酶和氨肽酶的活性，比较获得BBMV 的浓缩倍数，从而判断其纯度。

1.2.3 蛋白含量标准测定方法 以牛血清蛋白为标准，参照Bradford 的方法[20]测定。标准曲线制作：将1 mg/mL 的BSA 母液依次稀释为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL；依次取10 μL 加入到96 孔板内，再加入190 μL 考马斯亮蓝G-250 溶液，混匀后室温放置5～10 min，使用酶标仪在595 nm 处读数。

样品测定：将待测样品稀释至合适浓度，测定方法同标准曲线制作方法。

1.2.4 杠柳新苷类化合物对氨肽酶的活性测定 将供试6 个杠柳新苷类化合物用DMSO 配制成20、40、80 和200 μmol/L。氨肽酶的活性参考Hafkenscheid 等的方法[21]以Leu-pNA 为底物进行测定。称取Leu-pNA 15.96 mg 溶于1 mL 甲醇中(现用现配)。在1.5 mL 无菌无酶离心管中加入底物反应缓冲液1 mL，分别将待测蛋白样品10 μL，或其与杠柳新苷类化合物、阳性对照药剂Bestatin 1.6 μL，于37 ℃水浴锅中孵育30 min；再加入底物Leu-pNA 16 μL，于37 ℃水浴锅中反应60 min。最后用全波长酶标仪于405 nm 下测定其相应吸光度。

1.2.5 杠柳新苷类化合物对碱性磷酸酶的活性测定 将供试6 个杠柳新苷类化合物用DMSO 配制成20、40、80 和200 μmol/L。碱性磷酸酶活性参照Lowry 等的方法[22]测定。在96 孔板中分别加入0.5 mL 酶液、2 mL 0.04 mol/L 的巴比妥钠盐酸缓冲液、或者1.75 mL 0.04 mol/L 的巴比妥钠盐酸缓冲液、0.25 mL 杠柳新苷类化合物或阳性对照药剂Na2VO4、0.5 mL 7.5 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠，于37 ℃温浴30 min。取出后加入2 mL 0.1 mol/L 的氢氧化钠终止反应。常温下平衡15 min，利用全波长酶标仪于405 nm 测定其相应吸光度值。

1.2.6 杠柳新苷类化合物对V-ATP 酶的活性测定 参照Tiburcy 等的方法测定[23]。挑取6 龄初未饥饿东方黏虫幼虫，解剖取中肠，弃去内容物及围食膜。在解剖镜下于预冷的Ringer Solution中去除马氏管及食物残渣，取中肠后部置于预冷的低吸附EP 管中。于液氮中迅速冷冻后，加入20 μL Lysis buffer-PIC，于冰上用微量匀浆棒充分匀浆，补足体积至200 μL。于20 000 r/min、4 ℃下离心20 min；弃去上清液，加入200 μL Lysis Buffer-PIC，重悬沉淀，于20 000 r/min、4 ℃下，离心20 min。弃去上清液后，将沉淀溶解于200 μL Lysis Buffer + PIC，采用Broadford 法测蛋白浓度后，用于后续酶活测定。

于1.5 mL EP 管中分别加入50 μL Buffer PO、20 μL MV 和20 μL KN，随后加入40 μL 上述步骤获得的酶液、10 μL DMSO 或供试化合物或Bafilomycin A1 (阳性对照)，每处理3 次重复。于30 ℃孵育10 min 后，依次向每个离心管中加入20 μL 底物Tris-ATP (8 mmol/L)，于30 ℃孵育1 h。终止反应时，依次按照加入底物的顺序将离心管置于液氮中，于 -20 ℃保存用于无机磷含量测定。

无机磷含量测定参考Wieczorek 等方法[24]。于1.5 mL 离心管内吸取100 μL 钼酸盐 (molybdate)溶液，向酶促反应后的样品管1 内加入50 μL 20%三氯乙酸 (TCA) 溶液，于70 ℃反应15 s；随后分别于30 s、1.5 min 和2 min 时依次向样品管2、3、4 中加入50 μL TCA 溶液，于70 ℃反应15 s。2 min 时，将样品管1～4 离心1 min。分别于3.5、4、4.5 和5 min 时，依次取样品管1～4 中的上清液60 μL，加入到100 μL molybdate 中溶解并混匀；反应15 s 后，依次向上述混合液中加入30 μL 孔雀石绿，混匀；反应2 min 后，再依次向上述混合液中加入200 μL H2SO4并混匀；室温孵育70 min 后于625 nm 波长下测定其吸光度。

参考Cheng 等方法[25]通过标准曲线计算得到无机磷的含量：将105 ℃烘干至恒重的KH2PO4用双蒸水 (ddH2O) 配制成1 mmol/L 的母液，再用ddH2O 将母液稀释50 倍，制成0.02 mmol/L 的标准溶液。取10 个不同量的标准溶液分别于10 个试管内 (浓度分别为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 mmol/L)，加入ddH2O 使每个试管内的体积均为1 mL。每管内加入0.5 mL 20% TCA 和0.4 mL 酸性钼酸钠，摇匀后15 s，再加入0.3 mL孔雀绿试剂，反应2 min 后加入2 mL 7.8%硫酸，室温放置70 min 后，于625 nm 处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，磷的含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.7 数据统计分析 数据分析均采用SPSS20.0软件 (SPSS Inc., Chicago, USA) 进行统计分析。光度计测定数据均采用平均值 ± 标准差 (Mean ± SD)表示。组间比较采用单因素方差分析 (One-way ANOVA)，P ＜ 0.05 为差异显著。每个独立试验及处理均至少进行3 次生物学重复。

2 结果与分析

2.1 杠柳新苷类化合物的杀虫活性

测定结果如表1 所示：在6 个化合物中，PSP和PST 对3 龄东方黏虫幼虫表现出较强的杀虫活性，其LC50值分别为1.60 和1.23 mg/mL；PSA、PSD 和PSF 均表现出微弱的杀虫活性，其LC50值分别为28.68、22.44 和21.31 mg/mL；PSE 则无明显杀虫活性。

2.2 杠柳新苷类化合物对BBMV 中氨肽酶和碱性磷酸酶活性的影响

结果表明，6 个杠柳新苷类化合物在20、40、80、200 μmol/L 浓度下，对氨肽酶和碱性磷酸酶的活性均没有明显抑制作用，与溶剂对照DMSO组的结果相同。而阳性对照氨肽酶特异性抑制剂Bestatin 在10 μmol/L 下对氨肽酶的抑制率可达到50%以上，碱性磷酸酶特异性抑制剂Na2VO4在100 μmol/L 下对碱性磷酸酶的抑制率可达到70%以上。

2.3 杠柳新苷类化合物对V-ATP 酶活性的影响

杠柳新苷类化合物对东方黏虫幼虫中肠细胞BBMV 中V-ATP 酶活性的影响如图1 所示。阳性对照Bafilomycin A1 为V-ATP 酶一种特异的抑制剂，在所有单独试验组中均表现出显著抑制，在3 μmol/L 浓度下抑制率达到45%左右；而6 个化合物中，仅有PSP 和PST 对V-ATP 酶表现出显著抑制，PSA、PSD、PSE 和PSF 对其均无显著的抑制作用。

为验证杠柳新苷类化合物对V-ATP 酶活性影响的准确性，每组试验中均设置了阳性对照和杠柳新苷的联合处理。如果杠柳新苷的作用对象不是V-ATP 酶而是其他酶类，那么联合用药处理后其抑制效果将呈现加成作用，其抑制率将明显高于二者单独作用时的处理效果。从图1 可以看出，在联合用药下，对V-ATP 酶活性的影响均与阳性对照Bafilomycin A1 无显著性差异，这也进一步说明杠柳新苷类化合物PSP 和PST 确实抑制了V-ATP 酶的活性。另外，从图1E 和1F 中可以看出，杠柳新苷对V-ATP 酶的活性表现出一定的浓度依赖性。因此，推测V-ATP 酶为杠柳新苷类杀虫活性化合物的作用靶酶。

3 讨论与结论

生物测定结果表明，在6 个供试杠柳新苷类化合物中，PSP 和PST 对3 龄东方黏虫幼虫表现出较强的杀虫活性，PSA、PSD 和PSF 仅具有微弱的杀虫活性，而PSE 则无明显杀虫活性。对3 种疑似靶标酶酶活影响的测定结果表明，6 个杠柳新苷类化合物对东方黏虫幼虫中肠细胞BBMV中的氨肽酶和碱性磷酸酶均无显著作用；而对于V-ATP 酶，只有高杀虫活性的PSP 和PST 对其酶活有显著的抑制，且具有明显的浓度依赖性，其余化合物对V-ATP 酶的活性在测定浓度内均无显著影响；同时，阳性对照药剂Bafilomycin A1 与杠柳新苷类化合物的联合用药进一步验证了这一结果。基于此，本研究认为氨肽酶和碱性磷酸酶不是杠柳新苷类杀虫活性化合物在东方黏虫幼虫中肠的作用靶标，而其活性位点可能存在于V-ATP酶上。

V-ATP 酶，又称为液泡 (vacuolar) ATP 酶，最早是由Anraku 与其同事于1981 年首次在酵母细胞的液泡膜上发现的一种传输质子的ATP 酶[26]。此后，在各种动植物和真菌中也陆续发现了V-ATP酶的存在[27]。目前，发现V-ATP 酶广泛存在于细胞原生质膜和各种细胞器内膜系统，如溶酶体、内膜体、高尔基体和分泌颗粒等[28]。V-ATP 酶水解ATP，产生的能量维持质子 (H+) 转运，从而建立跨膜质子电化学梯度，实现膜内外pH 值调节，酸化细胞内外环境，为后续的细胞内吞、外泌和物质转运等生理生化反应提供了必需条件[29]。最近对植物杀虫剂苦皮藤素的相关研究表明，VATP 酶H 亚基可能为苦皮藤素在昆虫体内的一个作用靶标，并由此提出一个苦皮藤素作用于VATP 酶的假说，即苦皮藤素等活性化合物与VATP 酶H 亚基上的某些氨基酸相互结合，从而抑制了V-ATP 酶全酶形态的形成，进而影响其活性，使其不能发挥正常作用[7]。理论上，如果活性化合物可与V-ATP 酶的某个亚基结合，但若不能抑制全酶的活力，则不能对其功能产生影响，对昆虫也就无任何作用。因此，对于酶学研究而言，首先应明确活性化合物是否对全酶活性产生了影响，再进而研究其具体的作用机理。本研究结果表明，杠柳新苷类杀虫活性化合物可显著抑制东方黏虫幼虫中肠细胞BBMV 中V-ATP 酶的活性。定量差异蛋白组学研究表明，东方黏虫幼虫取食杠柳新苷类杀虫活性化合物后，其中肠细胞BBMV 中的V-ATP 酶A 亚基表现出显著的上调表达[17]。蛋白组学分析发现，经Cry1Ac 毒素处理的烟芽夜蛾 Heliothis virescens 幼虫中肠细胞BBMV 中的V-ATP 酶A 亚基表现出上调，推测毒素与A 亚基结合可干扰H+/K+的正常转运，破坏了离子平衡及pH 值的稳定性，认为V-ATP 酶A 亚基为Cry1Ac 毒素在烟芽天蛾中肠的一个特异结合蛋白[30]。同样，蛋白组学研究表明，棉铃虫Helicoverpa armigera 幼虫经Bt 处理后，其中肠细胞BBMV 中的V-ATP 酶A 亚基也表现出显著的上调表达，推测昆虫体内需要大量的能量用于应对毒素压力，而A 亚基的大量表达正是用于更多能量的提供[31]。本研究中杠柳新苷类杀虫活性化合物引起东方黏虫幼虫中肠细胞BBMV 中的VATP 酶A 亚基上调表达的原因可能与上述研究推测相似，即昆虫幼虫在取食活性化合物后，为应对这外源物胁迫压力，昆虫中肠需要消耗更多的能量，导致昆虫中肠内的V-ATP 酶A 亚基的数量大量增加。但是，对于昆虫体内V-ATP 酶全酶活性而言，导致其被抑制的因素有很多，如温度、pH 环境，或者亚基之间的组装过程，复合体V0与V1之间的装配过程等等，与单亚基本身数量的多少并没有必然联系[32]。基于此，笔者推测杠柳新苷类活性化合物可能与V-ATP 酶A 亚基相互结合后改变了A 亚基的正常构型，使V0和V1复合体不能正常解离和装配，进而造成V-ATP酶全酶构型发生改变，致使全酶活性降低或者丧失。

鉴于杠柳新苷类杀虫活性化合物对氨肽酶和碱性磷酸酶的活性无影响，却显著抑制了VATP 酶的活性，并表现出一定的浓度依赖性，结合定量差异蛋白质组学的研究结果，笔者认为杠柳新苷类杀虫活性化合物的初始作用位点位于VATP 酶A 亚基上。此发现对研究杠柳新苷类杀虫活性化合物的具体作用机制具有重要的指导意义，为进一步发现并验证其特异靶标位点奠定了理论基础。