浙江省医疗器械检验研究院 （浙江 杭州 310018）

内容提要：阐述了对于动物源性医疗器械免疫毒理学评价的思考。主要介绍了动物源性医疗器械的种类以及关于动物源性医疗器械的国内外法规，同时详细介绍分析了动物源性医疗器械免疫毒理学评价的具体检测方法，同时对动物源性医疗器械免疫学评价进行总结和展望。

“动物源性医疗器械”顾名思义，说明其生产过程采用的材料是动物来源的。在医疗器械生产、制造、加工、设计中，动物源性医疗器械因其使用的材料都是动物组织及其衍生物来源的，而动物源性材料的来源便捷，其研发生产逐渐成为热点，临床使用也越来越常见[1]。虽然动物源性医疗器械材料相比非动物源性材料在生物相容性方面表现优异，且动物源性医疗器械的使用也越来越常见，但在临床应用的安全性方面也不得不重视，因为其存在一定不可控风险性，需要进行评价思考，包括其中的微生物以及细胞类物质的污染扩散，以及超敏热原带来的特殊刺激反应和免疫相关的毒理学反应等[2]。同时，动物源性医疗器械在生产加工过程中会出现残留的组织蛋白、抗原和核酸等物质，同时也可能会有其他特别的物质影响人体免疫系统发挥其功能，这些物质会引起的免疫系统反馈功能，也会发生排异反应或者免疫毒理学反应，如人体受刺激与功能损伤等。因此，动物源性医疗器械需要对其免疫毒理学进行评价试验。本文就动物源性医疗器械在免疫毒理学的评价做一思考与探讨。

1.动物源性医疗器械

动物源性医疗器械材料是动物源性来源的，所以其种属相对来说比较广泛，包括鼠、兔、牛、羊、猪等动物。这些材料构成的医疗器械主要有[2-4]：①心脏或组织等的修补材料，如猪心包膜、心脏以及组织补片等；②植入类材料：如人工骨组织、骨修复相关材料、骨填充相关材料等；③眼科类材料，如角膜（异体源）、眼内充填动物源性材料等；④接触式人工器官，如人工皮肤等；⑤可吸收性止血以及防粘连相关材料，如医用生物蛋白胶、医用透明质酸等；⑥缝合线类材料，如医用可吸收缝合线、羊肠线等。

同时动物源性医疗器械还包括医疗器械制造产品过程中使用的生物学涂层（如肝素、胶原等），或一些相关的生物性辅助材料（如牛脂、牛血清蛋白、新生牛以及胎牛血清、生物酶、培养基等）[2-4]。

2.动物源性医疗器械免疫毒理学评价的相关法规

2.1 国外相关法规对动物源性医疗器械指导原则

美国FDA于1998年发布了医疗器械审评和行业指南，对动物源性医疗器械有一个指导性的行业指南[5]。又于1999年发布了《免疫毒理学试验指导原则》[6]，针对各种材料在与人体接触过程涉及的不同途径和不同的时间，给出了免疫毒理学评价的指导原则和意见，并提出了可供参考的评价试验方法。同时，ASTMF 1905[7]给出了材料免疫毒性检测试验的标准技术规范，ASTM F 1906[8]也规定了以下免疫学试验的技术规范的具体试验方法，包括酶联免疫吸附测定免疫球蛋白以及补体试验、淋巴细胞增殖转化试验以及淋巴细胞迁移试验。而免疫毒理学指导原则中最重要的是ISO 10993-20[9]，该标准对免疫学评价试验有了进一步的完善，有了基本的免疫毒理学评价框架，各项指标的指南指导意见，但是只含有一些技术评价参考图，未给出具体的免疫学试验方法。

2.2 国内相关法规对动物源性医疗器械指导原则

我国于2009年，根据ISO 22442转化的YY/T 0771[10-13]动物源性医疗器械系列对动物源性医疗器械的风险分析和管理都做了严格的规定。其中，第1部分包含风险管理应用，第2部分包含来源、收集与处置的控制，第3部分包含病毒和传播性海绵状脑病（TSE）因子去除与灭活的确认，第4部分包含TSE因子去除与灭活原则及其验证试验。然而这一系列标准仅在第一部分规定了鉴别动物源性医疗器械相关的危害与危害情况的判定，对所产生风险的评价、控制和管理，以及在管理控制的基础上进行有效性的监视，除此以外，其他几部分都侧重动物源性医疗器械在生产、制造、加工过程中微生物的去除以及防控管理的试验方法确认，对免疫毒理学试验评价并未涉及。

同时我国于2014年，根据ASTM标准中规定的免疫毒理学试验方法，发布了YY/T 0606[14-16]组织工程医疗产品系列标准，其中第14、15、20部分，分别给出了用酶联免疫吸附测定免疫球蛋白以及补体试验、淋巴细胞增殖转化试验以及淋巴细胞迁移试验的具体方法。而YY/T 0606组织工程医疗产品系列标准的第25部分《组织工程医疗产品—动物源性生物材料DNA残留量测定法—荧光染色法》[17]该标准细阐述了动物源性医疗器械材料残留DNA的定量检测方法。

在2015年，我国发布的GB/T 16686.20《医疗器械生物学评价第20部分：医疗器械免疫毒理学试验原则和方法》[18]，其等同转化自ISO 10993-20，该标准对免疫毒理学评价有进一步的改善，对一些免疫学功能性和非功能性指标的评价有了基本的框架，但未给出具体的试验方法。

在2017年，我国又发布了YY/T 1465《医疗器械免疫原性评价方法》[19-22]系列标准，其中，第1、2、3、5部分分别规定了体外T淋巴细胞转化试验的MTT法和CFSE法，用酶联免疫吸附试验测定血清免疫球蛋白和补体成分的方法，适用琼脂固相法测定空斑形成细胞的方法，适用于评价医疗器械（或材料）对人体体液免疫功能的影响，α-Gal抗原清除率的方法，这一系列标准给出了免疫毒理学评价的具体方法，这一系列标准是对GB/T 16686.20补充以及免疫毒理学评价可参考的依据。

对于动物源性医疗器械，我国还在2017年发布了行业标准《组织工程医疗器械产品动物源性支架材料的残留α-Gal抗原检测》（YY/T 1561-2017）[23]，该标准为进一步评价免疫原性残留物提供可参考的标准依据。

3.动物源性医疗器械免疫毒理学评价具体试验

3.1 DNA残留量测定

我国于2014年颁布了行业标准《组织工程医疗器械产品第25部分：动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》（YY/T 0606.25-2014）[17]，该标准为动物源性医疗器械测定DNA残留量提供方法。众所周知，为了更好地去除异种免疫原性，同时减少免疫系统的排斥反应，动物源性医疗器械的材料所采用的组织基质类材料大都是经过脱细胞处理的。因此，DNA残留量检测是动物源性医疗器械组织基质类生物材料进行工艺评价的重要指标之一[17]。药典中虽有涉及可参考的DNA残留量检测方法，但不全适用于医疗器械检测，因为动物源性医疗器械产品大都是固体或者凝胶类的材料，这些材料只有经过样品前处理，处理完后，残留的DNA得到释放，释放之后方可进行含量检测试验。另外，由于组织基质类材料的主要成分是基质纤维蛋白，虽然经过了充分的消化，但是基质纤维蛋白一定仍有残留，其残留量对检测DNA残留量依旧有很大的干扰，因此需要通过纯化提取残留的DNA的方式，减少干扰之后再进行DNA残留量的测定[17]。因此常常采用的步骤是先用酶来分解组织基质，释放出基质中含有的DNA，之后进行DNA纯化以及提取（增加回收率实验），最后在通过荧光染色法进行DNA含量的测定[24]。

根据YY/T 0606.25-2014[17]可知，DNA残留量是细胞基质类生物材料进行脱细胞工艺的评价指标，为了降低DNA残留不建议使用核酸分解酶，虽然异种来源的核酸本身会引起一些免疫排斥反应，但不是主要的风险因素。该方法虽降低了核酸的残留，排除了核酸的免疫排斥反应，但不能减少其他细胞成分的残留，以及蛋白层面的残留，达不到降低整体免疫排斥反应的目的，反而有可能引入了核酸分解酶试剂中的一些其他风险物质。而对于DNA残留量的安全限值制定，需要考虑很多因素，比如材料的来源、材料的成分、材料的剂量、材料与人体接触的部位、材料是否易降解等，同时结合免疫原性残留物的风险评估和风险控制等因素，共同来确定DNA残留量限量值[17]。

因此，动物源性医疗器械把DNA残留量测定作为一项必检项目，用以评价产品生产、制造、加工、设计过程的有效性、安全性和质量控制。

3.2 α-Gal抗原残留检测

动物源性材料在植入人体内后，对于人体是一种异源性物质，其表面的α-Gal抗原极易与人体内已经存在的抗α-Gal抗体结合，这种结合会立即激活人体免疫系统，引起严重的人体异源性排斥反应，植入因此而失败[25]。与此同时还会产生一些长期慢性的局部免疫反应，导致了植入的动物源性材料会出现纤维化，形成包囊，最后以填充在局部组织的异物形式存在，使得组织再生和重塑变得不可能达成。

α-Gal抗原本质上就是一种蛋白或脂类物质，这种抗原在许多哺乳动物组织都有表达，如大鼠、兔、牛、羊和猪等[23,26-30]。国外在有研究报道于1984年，首次发现在正常人体血清中存在能与α-Gal特异结合的抗体，即抗α-Gal抗体，由于动物源性材料含有Gal抗原，当人体接受含有Gal抗原的异种材料植入组织时，会导致一系列免疫排斥反应或长期或慢性[31,32]。因此，把α-Gal抗原作为免疫毒理学评价指标，用于评价动物源性医疗器械免疫原性风险控制主要方法。

α-Gal抗原检测方法主要有，免疫组织化学法和酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测两种。而行业标准《组织工程医疗器械产品动物源性支架材料的残留α-Gal抗原检测》（YY/T 1561-2017）规定了α-Gal抗原检测试剂盒，同时采用的是酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测，减少评价过程中的风险[23]。

3.3 其他免疫风险指标检测

由于动物源性医疗器械易出现各个免疫指标的残留风险，因此需对动物源性医疗器械的免疫毒理性残留风险进行评价。采用免疫毒理学常用的评价方法。

3.3.1 免疫系统评价

主要观察免疫系统中的组织，如胸腺和脾脏等的器官，细胞学（如B、T细胞和淋巴细胞亚群分析）和免疫相关脏器重量变化。同时包括血常规检测以及血生化指标检测。以上各个指标用于评价总体的免疫系统功能[18]。

3.3.2 免疫功能学检测

功能性检测主要包括非特异性和特异性免疫功能，其中非特异性免疫包括NK细胞杀伤活性，特异性免疫包含体液免疫和细胞免疫[18]。具体如下：①NK细胞杀伤活性测定主要通过提取脾脏或者外周血NK细胞来进行试验，从而观察其对敏感肿瘤细胞（小鼠YAC-1细胞株或人体K562细胞株)的杀伤作用。常用的方法有MTT法、乳酸脱氢酶（LDH）释放法以及流式细胞检测杀伤率的方法[33]。②体液免疫功能评价主要通过观察抗体形成细胞数或抗体生成量来评价体液免疫功能，试验方法有空斑形成细胞（Plaque Forming Cell，PFC）试验、免疫电泳法、ELISA法等[14,20,21]。③细胞免疫功能评价主要以T淋巴细胞增殖转化试验进行，其中的检测方法主要采用MTT以及流式细胞CFSE染色法[15]。

4.小结与展望

本文介绍了对于动物源性医疗器械毒理学评价的一些国内外标准，以及具体的免疫毒理学评价试验方法，为评价动物源性医疗器械有效性、安全性以及质量控制评价提供可以参考的依据。现颁布的标准仍然不足以充分地达到对动物源性医疗器械风险与质量控制，还需要考虑更全面评价，包括细胞膜成分如磷酸酯等物质的含量检测，残留细胞核酸的染色，以及其他残留的蛋白分子RNA等的定量检测等。动物源性医疗器械还需要检测微生物以及病毒指标，从而更好地达到风险控制的目的。同时在免疫毒理学评价方面，如非特异性免疫中的NK细胞杀伤作用也没有具体可以参考的标准和具体可以实施的方法，因此对于动物源性医疗器械免疫毒理学评价技术、方法、标准的完善道路依旧任重道远。