崔卫正，刘 爽

(邯郸市中心医院，河北 邯郸 056001)

脓毒症是一种由感染引起的全身性炎症反应综合征，每天约1.4万人死于其多器官功能障碍并发症[1]。急性肺损伤是脓毒症最常见的并发症，具有较高的并发率和致死率[2]。在内毒素(LPS)和炎症趋化因子作用下，肺组织炎症反应过度激活而导致肺功能障碍，继而诱发氧化应激损伤，是脓毒症急性肺损伤的主要病理机制[3-5]。芹菜素是一种天然存在的黄酮类化合物，以伞形科植物旱芹中含量较高而得名，其具有良好的抗氧化、抗炎、降压、抗肿瘤等作用[6-8]。本实验观察了芹菜素预处理对脓毒症大鼠急性肺损伤的保护作用，并从炎症反应、氧化应激损伤、NF-κB信号通路角度探讨了其可能作用机制，现将结果报道如下。

1 实验材料与方法

1.1实验动物与分组 180只SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(240±20)g，购自河北省实验动物中心[许可证号：SCXK(冀)2018-004]；开展实验前适应性饲养1周[12 h光照黑暗交替、(25±1)℃、相对湿度(55±5)%]。数字编码所有大鼠后，按随机数字表法随机分为假手术组、模型组、芹菜素低剂量预处理组、芹菜素中剂量预处理组、芹菜素高剂量预处理组和地塞米松预处理组，每组30只。实验过程严格按照国家卫生实验动物护理和使用指南进行。

1.2主要药物与试剂 芹菜素购自陕西慧科植物开发有限公司(纯度≥98%，批号：HK20190124)；地塞米松购自山东大陆药业有限公司(规格：1 mL∶5 mg，批号：1903016)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)酶联免疫(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司(批号：2019003，2019014，2018027)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号：20181125，20190307，20190114，20181206)；磷酸化核因子-κB(p-NF-κB)单克隆抗体购自上海碧云天生物技术有限公司(批号：201903017)。

1.3实验方法

1.3.1给药预处置和模型制备 ①给药预处置：精确称量芹菜素并加入适量0.9%氯化钠溶液制备浓度为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的芹菜素溶液，取地塞米松注射液加入适量0.9%氯化钠溶液制备浓度为2.5 mg/mL的地塞米松溶液；芹菜素低、中、高剂量预处理组分别于造模术前7 d开始1次/d腹腔注射给予浓度为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的芹菜素溶液，地塞米松预处理组同步腹腔注射给予浓度2.5 mg/mL的地塞米松溶液，假手术组和模型组同步给予0.9%氯化钠溶液，注射剂量均为2 mL/kg。②模型制备：参考文献[9]方法，实施麻醉后仰位固定，剔除腹部毛发，沿腹部正中切口3～5 cm，于回盲口和盲肠末端之间结扎盲肠，于结扎线和盲肠末端之间用18号穿刺针头对穿2次，挤出少量盲肠内容物，然后逐层缝合；假手术组除不盲肠结扎和穿刺外，其他操作同模型组。术后皮下注射0.9%氯化钠溶液(2 mL/100 g)抗休克。造模手术24 h后行各指标检测。

1.3.2肺功能检测 各组随机取大鼠10只，计数每分钟呼吸次数(呼吸频率)；实施麻醉、开腹、经腹主动脉取血、肝素抗凝，通过血气分析仪(NF05DH-1831型，广州华西科创科技有限公司)测定动脉血氧分压；取大鼠血浆及支气管肺泡灌洗液并通过溴甲酚氯法测定各自蛋白含量，肺泡通透指数=支气管肺泡灌洗液中蛋白含量/血浆蛋白含量。

1.3.3肺组织湿/干重比测定 取1.3.2中各组10只大鼠，脱臼处死后开胸取肺组织，0.9%氯化钠溶液冲洗、滤纸吸干后称重为湿重，置恒95 ℃烘箱24 h至重量不再变化为干重，然后计算肺组织湿/干重比。

1.3.4肺组织病理学检查及损伤评分 各组随机取大鼠10只，颈部脱臼处死，开胸取肺组织，0.9%氯化钠溶液冲洗后置4%多聚甲醛溶液固定72 h，常规石蜡包埋、5 μm厚度切片(CUT 4050型旋转切片机，德国Leica公司)，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水洗后行HE染色，脱水、二甲苯透明后封片，通过光学显微镜(CKX41型，日本Olympus公司)观察肺组织病理学变化。损伤评分：参照文献[10]分别对肺泡水肿、肺泡出血、炎症细胞浸润、肺不张、透明膜形成状况5个方面进行评价，正常、轻度、中度、重度分别计分0，1，2，3分，总计15分。

1.3.5肺组织内毒素(LPS)水平测定 取各组剩余的10只大鼠，麻醉后颈部脱臼处死，开胸取肺组织，经4 ℃预冷0.9%氯化钠溶液洗涤后研磨匀浆，匀浆液经4 ℃离心(离心半径15 cm、转速3 500 r/min、时间10 min)后取上清，然后通过细菌内毒素测定系统(EDS-99型，湛江正杰科学仪器有限公司)测定LPS水平。

1.3.6肺组织炎症和氧化应激指标检测 取1.3.5制备的肺组织匀浆液，经4 ℃离心(离心半径15 cm、转速3 500 r/min、时间10 min)后取上清，按照ELISA试剂盒操作方法步骤检测TNF-α、IL-1β、IL-6水平；硫代巴比妥酸法测定MDA水平，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，高锰酸钾滴定法测定CAT活性，生化分析法检测T-AOC活性。

1.3.7肺组织p-NF-κB蛋白表达量测定 取1.3.5制备的肺组织匀浆液，经4 ℃离心(离心半径15 cm、转速12 000 r/min、时间20 min)，提取总蛋白并由BCA法测定总蛋白含量后，沸水浴蛋白变性、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tetra Systerm型垂直电泳槽，美国Bio-Rad公司)、转PVDF膜(Power Pac Basic转膜槽，美国Bio-Rad公司)、5%脱脂奶粉室温封闭2 h，滴加兔抗鼠p-NF-κB单抗和兔抗鼠β-actin单抗后4 ℃孵育过夜，洗膜后滴加山羊抗兔IgG二抗，室温振荡孵育1 h，PBS洗膜后滴加DAB显色；以β-actin为内参，以条带灰度值对p-NF-κB蛋白进行半定量分析。

2 结 果

2.1各组大鼠肺功能指标比较 与假手术组比较，模型组大鼠呼吸频率和肺泡通透指数明显升高(P均<0.05)，动脉血氧分压明显降低(P<0.05)；与模型组比较，芹菜素中、高剂量预处理组和地塞米松预处理组呼吸频率和肺泡通透指数明显降低(P均<0.05)，动脉血氧分压明显升高(P均<0.05)；与地塞米松预处理组比较，芹菜素高剂量预处理组肺泡通透指数更低(P<0.05)，动脉血氧分压更高(P<0.05)。见表1。

2.2各组大鼠肺组织湿/干重比、病理学损伤评分和LPS水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织湿/干重比、病理损伤评分、LPS水平均明显升高(P均<0.05)；与模型组比较，芹菜素中、高剂量预处理组和地塞米松预处理组肺组织湿/干重比、病理损伤评分、LPS水平均明显降低(P均<0.05)；与地塞米松预处理组比较，芹菜素高剂量预处理组肺组织湿/干重比、病理损伤评分、LPS水平更低(P均<0.05)。见表2。

2.3各组大鼠肺组织病理学表现 HE染色显示，假手术组大鼠肺组织形态结构清晰，肺泡壁薄，未见炎性浸润；模型组可见肺间质水肿、肺泡壁增厚、大量炎症细胞浸润、肺泡内出血等病理学改变；芹菜素各剂量预处理组和地塞米松预处理组大鼠肺组织上述病理学改变明显轻于模型组，以芹菜素高剂量预处理组最轻。见图1。

表1 各组大鼠肺功能指标比较

表2 各组大鼠肺组织湿/干重比、损伤评分和LPS水平比较

图1 各组大鼠肺组织病理学HE染色表现(×400)

2.4各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显升高(P均<0.05)；与模型组比较，芹菜素中、高剂量预处理组和地塞米松预处理组TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显降低(P均<0.05)；与地塞米松预处理组比较，芹菜素高剂量预处理组TNF-α水平更低(P<0.05)。见表3。

2.5各组大鼠肺组织中MDA水平和SOD、CAT、T-AOC活性比较 与假手术组比较，模型组大鼠肺组织中MDA水平明显升高(P<0.05)，SOD、CAT、T-AOC活性均明显降低(P均<0.05)；与模型组比较，芹菜素中、高剂量预处理组和地塞米松预处理组MDA水平明显降低(P均<0.05)，SOD、CAT、T-AOC活性明显升高(P均<0.05)；与地塞米松预处理组比较，芹菜素高剂量预处理组MDA水平更低(P<0.05)，SOD活性更高(P<0.05)。见表4。

表3 各组大鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比较

表4 各组大鼠肺组织中MDA水平和SOD、CAT、T-AOC活性比较

2.6各组大鼠肺组织中p-NF-κB蛋白表达量比较 假手术组、模型组、芹菜素低剂量预处理组、芹菜素中剂量预处理组、芹菜素高剂量预处理组和地塞米松预处理组大鼠肺组织中p-NF-κB蛋白表达量分别为0.08±0.03，0.91±0.16，0.78±0.14，0.75±0.12，0.19±0.04，0.25±0.05，模型组明显高于假手术组(P<0.05)，芹菜素中、高剂量预处理组和地塞米松预处理组明显低于模型组(P均<0.05)，芹菜素高剂量预处理组明显低于地塞米松预处理组(P<0.05)。见图2。

A为假手术组；B为模型组；C为芹菜素低剂量预处理组；D为芹菜素中剂量预处理组；E为芹菜素高剂量预处理组；F为地塞米松预处理组

3 讨 论

脓毒症是临床较为常见的一种重症感染性疾病综合征，通过LPS诱导全身炎症反应、导致多器官功能衰竭是脓毒症的主要病理特征[11]。急性肺损伤是脓毒症早期即可出现的严重并发症，发生率达70%，治疗不及时其病死率达50%～70%[12]。所以，保护肺组织、减轻急性肺损伤对改善脓毒症治疗预后具有重要意义。

本研究采用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症大鼠模型，使肠道内容物进入腹腔，导致大量细菌和LPS进入肺组织而引发急性肺损伤，肺组织病理改变接近临床，是目前应用较多的造模方法。造模结果显示，脓毒症模型大鼠肺组织呈现肺间质水肿、肺泡壁增厚、大量炎症细胞浸润、肺泡内出血等病理性改变，与袁园等[13]报道一致。

芹菜素是一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化等多种药理学作用。Li 等[14]研究发现芹菜素对LPS导致抗氧化酶活性降低而出现的氧化应激具有抑制作用。王玉明等[15]研究发现芹菜素对LPS所致肺组织炎症反应具有抑制作用。本研究结果显示，芹菜素中、高剂量预处理组和地塞米松预处理组呼吸频率、肺泡通透指数、肺组织湿/干重比、病理损伤评分均明显低于模型组，动脉血氧分压明显高于模型组，肺组织病理学改变明显轻于模型组，且芹菜素高剂量预处理组各指标改善更明显，提示芹菜素预处理对脓毒症所致急性肺损伤大鼠肺组织病变、肺水肿、肺功能降低具有保护作用。

LPS是脓毒症导致多器官并发症的主要“介导者”，能够刺激中性粒细胞、巨噬细胞等释放大量炎症细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等。TNF-α除了能够直接损伤肺组织血管内皮细胞外，还能够通过结合其他炎症细胞的TNF结合蛋白而刺激机体免疫应激，进一步促进炎症因子的产生和释放，导致炎症级联反应的发生[16]；IL-1β为前炎性细胞因子，也能够进一步刺激免疫应激和炎症反应；IL-6能够导致氧自由基(ROS)大量释放，以ROS为底物的抗氧化酶SOD、CAT大量消耗，T-AOC活性降低，使ROS不能及时清除而导致肺组织氧化应激损伤[17]，其中MDA为脂质氧化应激反应的终产物。本实验结果显示，芹菜素预处理能够有效抑制脓毒症大鼠肺组织LPS、TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平升高和SOD、CAT、T-AOC活性降低，提示芹菜素预处理能够抑制脓毒症大鼠肺组织炎症反应和氧化应激损伤。

NF-κB信号通路对机体炎症反应具有重要的调控作用，NF-κB结构磷酸化(p-NF-κB)将激活NF-κB信号通路。邹宪宝等[18]研究发现脓毒症患者肺血管内皮细胞NF-κB信号通路被激活，诱导TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症细胞因子大量释放。何梅英等[19]研究证实白藜芦醇可通过抑制NF-κB信号通路而显著减轻脓毒症大鼠炎症反应。本实验结果显示，中、高浓度芹菜素预处理组p-NF-κB蛋白表达量明显低于模型组，提示芹菜素预处理对脓毒症急性肺损伤的保护作用可能与抑制NF-κB信号通路有关。

综上所述，芹菜素预处理具有抑制脓毒症大鼠急性肺损伤、保护肺功能的作用，其机制可能与抑制炎症反应、氧化应激及NF- κB信号通路有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。