杨殊琳 姚君宁 隋 聪 章汉旺 白 剑 饶 群

华中科技大学同济医学院附属同济医院(武汉，430000)

人类子宫内膜蜕膜化并不是由胚胎着床发动，但小鼠内膜蜕膜化必须依赖胚胎着床过程[1-2]。蜕膜细胞通过影响子宫内膜的容受性而影响胚胎着床和妊娠。临床上很多疾病如着床失败、反复流产、子宫内膜异位症和子痫前期均与基质细胞蜕膜化异常相关[3-7]。目前证实核因子(NF)-κB转录因子家族在细胞生长中发挥重要作用。核因子kappa-B激酶抑制剂(IKK)α和β在多种应激条件下决定细胞的存活或凋亡。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)在细胞从G1期进入S期过程中影响细胞周期进程[8]。对IKKα基因敲除细胞的研究显示，IKKα可介导cyclin D1 Thr286的磷酸化，使cyclin D1从细胞核转运至细胞质并被降解，从转录后途径下调cyclin D1的表达[9]。IKKα缺乏将导致cyclin D1过表达从而参与多种癌症的发生过程[10-11]。IKKα可从转录水平和转录后水平调控cyclin D1的表达，但是在子宫内膜基质细胞中对cyclin D1的调控方向并不清楚，对蜕膜化和胚胎着床的影响还需进一步研究。为了研究IKKα对cyclin D1的调控作用、对子宫内膜蜕膜化过程和容受性的影响，本研究以人和小鼠的子宫内膜基质细胞为对象，建立了体外和体内子宫内膜蜕膜化研究模型，从人和小鼠两方面探讨IKKα对cyclin D1的调控作用，以及在子宫内膜基质细胞的增殖、蜕膜化和胚胎着床过程中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1人原代细胞与细胞培养增生期子宫内膜均取材于2018年11月—2019年5月本院女性患者。纳入标准：①年龄25～30岁；②因男方因素导致不孕；③月经周期规律；④输卵管继发不孕。满足②/④+①+③即可纳入。排除标准：①子宫内膜病变；②内分泌异常；③近3个月内服用激素。病理检查结果均符合月经周期增生期时象改变。提取人子宫内膜基质细胞(hESCs)置于10%胎牛血清和1%青链霉素混合液的DMEM/F12培养基，在5%CO2、37℃孵育箱中培养。本研究经本院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.1.2实验动物及饲养条件实验动物操作程序均符合NIH实验动物管理与使用指南。6周龄雌、雄SPF级昆明小鼠各15只，购自湖北省实验动物研究中心，湖北省实验动物质量合格证编号：42000600007146、42000600006595、42000600006807；实验动物许可证编号：SYXK(鄂)2014-0049。小鼠体质量22～24 g，饲养于本院实验动物中心SPF级动物房，室温22～26℃，相对湿度50%～80%，每日给予12 h光照模拟昼夜变化，标准小鼠饲料自由进食和饮水，适应性喂养1周。本研究经本院实验动物伦理委员会审批。

1.1.3药物与试剂DMEM/F12培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM、lipofectamine2000购自美国Life Technologies公司；无水乙醇、BCA蛋白浓度测定试剂盒、PBS粉剂、50×蛋白酶抑制剂Cocktail、蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉、青链霉素混合液、DEPC水、Tween-20、甘氨酸、氯化钠、氯化钾、浓盐酸、Tris-base、SDS、甲醇、RNAse、碘化丙啶(PI)、ECL试剂盒、Western blotting配胶套装、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、RIPA裂解液均购于武汉谷歌生物科技有限公司；IV型胶原酶(LS004188)购于美国Worthington Biochemical Corporation；8-Br-cAMP 粉剂、MPA粉剂均购于美国 Sigma 公司; I型DNA酶(04536282001)购于美国Roche Applied Science公司；10-170KD蛋白Marker 购于美国Thermo Fisher公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TRIZOL、SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)购于日本Takara公司；IKKα(CHUK)/NC siRNA购于中国广州锐博锐博生物科技有限公司；β-actin兔抗小鼠/人多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔二抗购于武汉谷歌生物科技有限公司；IGFBP1兔抗人多克隆抗体购于美国GeneTex公司；IKKα兔抗小鼠/人单克隆抗体、Cyclin D1兔抗小鼠/人单克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.4体外转染相关siRNA序列由中国广州锐博锐博生物科技有限公司设计及合成。①IKKα(CHUK)siRNA 序列：正向 5’-UGUUCAUAGCCAUUUCUUC-3’；反向 5’-GAAGAAAUGGCUAUGAACA-3’。②siRNA NC序列：正向 5'-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'；反向 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’。③siRNA NC-FAM序列：正向 5'-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3'，修饰方式5'-FAM；反向 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’, 修饰方式5'-FAM。

1.1.5体内转染相关siRNA序列由中国广州锐博锐博生物科技有限公司设计及合成。①IKKα(Chuk)siRNA 序列：Sense 5’-CAGCAACUCAAAGCUAAAUTT-3’；Anti-sense 5’-AUUUAGCUUUGAGUUGCUGTT-3’。②siRNA NC序列：Sense 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；Anti-sense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。③siRNA NC-FAM序列：Sense 5'-UUCUCCGAACGUGUUCACGUTT-3'；Anti-sense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’,修饰方式5'-FAM。

1.1.6Real-time引物从NCBI查找核酸序列，用Primer Premier 5.0进行引物序列的设计，引物由武汉奥科生物技术有限公司合成，引物序列及预计扩增片段大小见表1。

表1 引物序列(5’-3’)

1.2 人子宫内膜基质细胞体外培养和蜕膜化模型建立

1.2.1hESCs原代分离培养传代培养至第三代时接种至6孔板，3孔采用配置好的8-Br-cAMP溶液40 μl、MPA 溶液2 μl和蜕膜化培养基1.96 ml(2%FBS)继续培养4 d诱导hESCs蜕膜化;另3孔使用蜕膜化培养基(2%FBS)培养基继续培养作为对照组。显微镜下观察蜕膜化干预第4日时细胞形态变化。Real-time PCR方法检测蜕膜化细胞中PRL和IGFBP1 mRNA表达。用LightCycler 96分析。

1.2.2Westernblotting检测PRL和IGFBP1蛋白表达恒定电流300mA转膜1h，兔抗人/鼠β-actin 多克隆抗体稀释比例为1:800，其余一抗稀释比例均为1：1000，HRP标记的羊抗兔二抗稀释比例为1：4000。用GENESys软件进行图片处理及分析。以 β-actin为内参，用Image J软件进行灰度值测定，GraphPad行灰度值半定量分析。

1.2.3流式细胞分选技术检测蜕膜化细胞周期变化①收集细胞离心；②用1 X PBS重悬洗涤细胞，离心弃上清(重复2次)；③用1.2ml 1 X PBS重悬细胞，加入2.8ml-20 ℃预冷的70%乙醇固定液，充分吹打混匀后-20 ℃过夜保存；④离心去上清，加入0.5 ml PBS重悬细胞(重复2次)。用0.1ml 1 X PBS细胞重悬；⑤向离心管中加入2.5μl RNAse(10ug/ml)置37℃恒温摇床消化1h；⑥向离心管中加入50 μl PI(0.1mg/ml)，4℃避光静置30min。根据细胞密度添加1 X PBS调整最终体积为400～500μl；⑦立即用流式细胞仪检测细胞周期；⑧用LuxScan 软件分析检测结果。以上实验重复3次。

1.2.4IKKα通过cyclinD1调控人子宫内膜基质细胞蜕膜化构建合成IKKα(CHUK)siRNA、阴性对照NC siRNA和FAM连接的NC siRNA，转染至体外培养hESCs中(CHUK组和NC组各3孔)，8 h终止转染并用8-Br-cAMP和MPA蜕膜化干预96 h，荧光显微镜下观察转染效率,显微镜下观察细胞形态变化。Real-time PCR方法检测IKKα、cyclin D1、PRL和IGFBP1 mRNA表达，Western blotting检测IKKα、cyclin D1和IGFBP1蛋白表达，流式细胞分析仪分析细胞周期(方法同1.2.1)。比较转染组和对照组细胞周期改变及cyclin D1、PRL和IGFBP1表达变化。以上实验重复3次。

1.2.5小鼠子宫内膜蜕膜化模型建立性成熟雌性昆明鼠与输精管结扎后的雄性昆明鼠合笼，见阴栓标记为D1(3只)。在第4日对一侧宫角注射蓖麻油模拟胚胎着床诱导蜕膜化，对侧宫角注射等量生理盐水作为自身对照。D7处死小鼠，HE染色显微镜下观察子宫内膜基质细胞的形态和内膜腺管，免疫组织化学观察IGFBP1的表达，Real-time PCR和Western blotting检测内膜细胞中IGFBP1、PRL的mRNA和蛋白表达(方法同1.2.1)。

1.2.6IKKα通过cyclinD1对小鼠子宫内膜蜕膜化过程及胚胎着床的影响性成熟雌性KM鼠与输精管结扎后雄性KM鼠合笼，见阴栓(D1)宫角注射(3只)IKKα(Chuk)/NC siRNA,在第4日再次双侧宫角注射蓖麻油模拟胚胎着床诱导蜕膜化。于D7处死小鼠，HE染色显微镜下观察子宫内膜基质细胞形态和子宫内膜腺管，免疫组织化学观察IGFBP1表达，Real-time PCR和Western blotting分别检测小鼠子宫内膜细胞中IKKα、cyclin D1、PRL和IGFBP1的表达。(方法同1.2.1)将性成熟雌性昆明鼠与正常雄性昆明鼠合笼，见阴栓(D1)宫角注射(3只)IKKα(Chuk)/NC siRNA,D6处死小鼠，记录双侧子宫受精卵着床位点。

1.3 统计学处理

采用Graph Pad分析。组间比较应用独立样本秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 8-Br-cAMP和MPA体外诱导hESCs蜕膜化

与对照组相比，8-Br-cAMP和MPA 蜕膜化组第4日hESCs形态由原本的长梭形变成多角形，细胞体积变大，细胞形状变圆，细胞核变大颜色变淡，细胞界限变模糊(图1A4，2247页)；而对照组hESCs形态则维持长梭形未发生变化(图1A2，2247页)。Real-time PCR检测第4日蜕膜化组细胞PRL mRNA水平(339.00±52.25 fold)高于对照组(1.00±0.07 fold)，IGFBP1(199.62±9.36 fold)高于对照组(1.00±0.29 fold)(均P<0.0001)。Western blotting检测第4日蜕膜化组细胞IGFBP1的蛋白水平高于对照组(4.86±0.30 比1.23±0.16)(P<0.0001)(图1B，2247页)。体外蜕膜化过程中hESCs发生了G0-1到S期的阻滞，G0-1期细胞蜕膜化组(88.12±0.10)%比对照组(82.98±0.42)%(P=0.0003)，S期细胞蜕膜化组(1.36±0.13)%比对照组(7.36±1.12)%(P=0.00061)(图1C，2247页)。

2.2 下调IKKα后Cyclin D1过表达及hESCs体外蜕膜化

转染NC siRNA-FAM组转染效率见图2A(2248页)，hESCs形态由长梭形转变为多角形，细胞体积变大变圆，细胞核变大颜色变淡，细胞界线变模糊(图2B4，2248页)；IKKα siRNA转染的基质细胞形态未发生明显变化(图2B2，2248页)。转染IKKα(CHUK)siRNA组，Real-time PCR和Western blotting检测到hESCs中cyclin D1的表达水平均提高，mRNA水平IKKα转染组(11.00±0.13 fold)高于对照组(1.15±0.18 fold)(P<0.0001)；蛋白水平IKKα转染组(3.69±0.22)高于对照组(2.26±0.23)(P=0.0112)，PRL、IGFBP1表达水平均低于对照组(PRL mRNA 1.00±0.33 fold比405.31±101.10 fold)(P=0.0161)，(IGFBP1 mRNA 1.00±0.33 fold比 637.81±194.00 fold)(P=0.0304)；IGFBP1 蛋白水平灰度IKKα转染组0.96±0.11比2.62±0.15(P=0.0008)(图2C，2248页)。与转染组相比，对照组S期细胞比例从(12.68±0.70)%下降至(2.87±0.03)%(P=0.0001)，G0-G1期细胞比例从(78.74±1.03)%升高至(86.74±0.47)%(P=0.0021)，发生了G0-1到S期的阻滞(图2D，2248页)。

2.3 假孕小鼠宫角注射蓖麻油诱导子宫内膜蜕膜化

小鼠子宫大体观示，注射蓖麻油侧宫角明显增粗，如图3A(2248页)。HE染色可见注射蓖麻油侧宫角子宫内膜明显增厚，内膜基质细胞增大变圆且内膜腺体明显增生扩张。免疫组化结果显示，与注射生理盐水侧相比，注射蓖麻油侧宫角内膜基质细胞和腺上皮细胞均高表达IGFBP1，如图3B(2248页)。Real-time PCR检测到注射蓖麻油侧PRL(338.99±52.25 flod)和IGFBP1(199.62±9.36 flod)表达高于对照侧(1.00±0.07 fold, 0.99±0.30 fold)(P=0.0029、P<0.0001)；Western blotting检测到注射蓖麻油侧IGFBP1表达(灰度6.47±0.66)高于对照侧(灰度1.90±0.26)(P=0.0030)(图3C，2248页)。

2.4 下调IKKα表达Cyclin D1过表达及小鼠子宫内膜蜕膜化和胚胎着床

在假孕小鼠子宫内膜蜕膜化模型的基础上干扰IKKα的表达，并验证转染效果，不同激发波长下的转染效率如图4B(2249页)。转染侧宫角和对照侧宫角均增粗，内膜增厚(图4A，2249页)。HE染色显示NC转染侧宫角腺管增生扩张，基质细胞核增大深染。IKKα转染宫角基质细胞核大深染，未见增生扩张的腺管。免疫组织化学检测IKKα转染侧宫角IGFBP1表达量低于对照侧(图4C，2249页)。转染侧IKKα(CHUK)、PRL和IGFBP1表达低于对照侧(IKKα1.33±0.31 fold比8.10±1.18 fold，P=0.0052,灰度IKKα0.41±0.29比2.32±0.15，P=0.004；PRL 1.00±0.33 fold比471.97±54.89 fold，P=0.0010；IGFBP1 0.99±0.33 fold比671.14±74.00 fold，P=0.0008，灰度0.98±0.40比6.33±0.76，P=0.0033)，cyclin D1表达高于对照侧(10.00±0.59 fold 比2.49±0.21 fold，P=0.0003，灰度2.64±0.67 比 0.97±0.29，P=0.0427)(图4D，2249页)。真孕小鼠IKKα转染侧胚胎着床数少于NC转染侧(5.33±0.49比9.67±0.33，P<0.0001)(图4E，2249页)。

3 讨论

蜕膜化是子宫内膜获得容受性的必要过程。当胚胎着床发生时，蜕膜化的基质细胞包绕胚胎与之建立起直接联系，并产生一系列细胞因子活化血管内皮细胞、免疫细胞和上皮细胞，在胚胎的识别和选择中发挥作用。子宫内膜蜕膜化过程伴随着细胞周期改变，cyclin D1作为G0-G1期关键蛋白，在细胞周期的调控中发挥了重要作用[12-13]。研究显示，IKKα在哺乳动物上皮细胞中可通过RANK/RANKL介导的NF-κB活化促进细胞周期蛋白D表达[9]。IKKα基因敲除小鼠表皮细胞的失控增殖也提示了IKKα在细胞增殖中作用[14-15]。提示IKKα与细胞周期的关系。Cyclin D1在细胞中分布具有细胞周期特异性。新合成的cyclin D1与CDK4/6结合被转运至细胞核介导pRb磷酸化。在细胞周期的S期，cyclin D1仅存在于细胞质内[16]。研究显示，在IKKα-/-细胞中，cyclin D1稳定存在于细胞核中，当回补IKKα时，cyclin D1的这种分布特性消失。研究证实IKKα可通过 T细胞因子(Tcf)转录因子介导cyclin D1 Thr286的磷酸化[17]。因此，IKKα可介导cyclin D1 Thr286的磷酸化，使其从细胞核转运至细胞质并降解，从而从转录后途径下调了cyclin D1的表达[18]。

为研究IKKα介导的cyclin D1下调是否在蜕膜化过程中具有调控作用，本研究以hESCs体外培养为基础，给予8-Br-cAMP和MPA干预诱导体外蜕膜化过程。结果显示，在体外hESCs蜕膜化干预4 d时细胞形态变为明显的蜕膜化细胞状态，IGFBP1和PRL水平升高，hESCs细胞发生G0-G1到S期的阻滞。为明确IKKα对cyclin D1表达的调控在hESCs蜕膜化过程中的影响，本研究构建了IKKα的siRNA，通过体外转染子宫内膜基质细胞，并给予8-Br-cAMP和MPA诱导蜕膜化。检测干扰IKKα RNA后蜕膜化干预96h时cyclin D1、IGFBP1和PRL的表达，结果显示下调IKKα时，cyclin D1表达显著上调，IKKα siRNA转染组IGFBP1和PRL表达水平低于NC siRNA转染组。细胞周期结果显示IKKα siRNA转染组细胞周期未发生明显变化，而NC siRNA转染组细胞周期发生了G0-G1到S期阻滞。以上结果提示，下调IKKα通过过表达cyclin D1促进hESCs增殖抑制其分化，导致其无法发生蜕膜化。

在动物试验中，本研究利用蓖麻油宫角注射技术成功建立体内蜕膜化模型，结果发现注射蓖麻油侧宫角明显增粗，内膜增厚，形态学观察见子宫内膜大量腺管增生扩张，基质细胞核大深染，发生蜕膜化样变化。腺上皮细胞和基质细胞广泛高表达IGFBP1，GFBP1和PRL表达高于对照侧。说明本研究建立的小鼠体内蜕膜化模型是成功的。为进一步研究IKKα对cyclin D1表达的调控在体内蜕膜化过程中的影响，我们利用IKKα siRNA转染一侧宫角并双侧宫角注射蓖麻油诱导蜕膜化过程，结果显示双侧宫角均增粗，内膜增厚，HE染色显示IKKα siRNA转染侧基质细胞增生核变大深染，但未见增生扩张的腺体，IGFBP1表达量未升高。NC siRNA转染侧腺体明显增生扩张，基质细胞核增大变圆深染发生蜕膜化样改变，IGFBP1表达量升高，广泛表达于内膜基质细胞和腺上皮细胞。与NC siRNA转染侧相比，IKKα转染侧内膜中cyclin D1表达水平上调，IGFBP1和PRL表达水平低于NC转染侧。蛋白表达水平与RNA表达水平趋势一致。IKKα siRNA转染侧胚胎着床数少于NC siRNA转染侧。提示NC转染侧宫角蜕膜化成功，IKKα转染侧宫角基质细胞发生了蜕膜化(因活体是复杂的网络，单一的干预因素造成的改变可被其他途径代偿)但是内膜腺体和血管均未完成蜕膜化过程，IGFBP1和PRL等蜕膜化相关因子分泌低于对照组。子宫内膜这种不完全的蜕膜化改变最终影响了胚胎着床。故认为，干扰IKKα的表达使cyclin D1过表达，可影响小鼠子宫内膜蜕膜化过程中腺体改变，最终造成蜕膜化过程不完全，从而影响胚胎着床。

综上所述，本研究建立了体外和体内子宫内膜蜕膜化研究模型，从人和小鼠两方面进行论证，探讨了IKKα对cyclin D1的调控作用对子宫内膜蜕膜化过程和胚胎着床的影响。下调IKKα的表达导致cyclin D1过表达，可以抑制子宫内膜蜕膜化并影响胚胎着床。该结论有望揭示部分反复着床失败和早期流产患者的病理生理机制，为辅助生殖技术提供新的治疗靶点。