袁伟康，戚南山，廖申权，Mudassar Mohiuddin，李跃龙，吕敏娜，吴彩艳，李 娟，林栩慧，蔡海明，胡俊菁，于林增，肖文婉，张健騑，曹 正1,，孙芸芸1,，孙铭飞*，顾有方

(1.安徽科技学院 动物科技学院，安徽 凤阳 233100；2.广东省农业科学院 动物卫生研究所 农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站 广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东 广州 510640；3.广东省农产品质量安全中心，广东 广州 510640)

鸡坏死性肠炎又称鸡肠毒血症，于1961年首次报道于英国，严重危害养鸡业的发展。随着集约化养鸡业的发展，目前该病已成为家禽养殖中最重要的肠道疫病之一。该病是一种由革兰阳性、厌氧、有芽孢的产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)引起的疫病[1-2]，该菌株产生的毒素多达17种，但单一的菌株只能产生某些特定毒素。目前根据分泌毒素种类和致病性的不同，将产气荚膜梭菌分为A～G共7个型：其中A型产气荚膜梭菌产生alpha (α，CPA)毒素，B型产气荚膜梭菌产生α、beta (β，CPB)和epsilon (ε，ETX)3种毒素，C 型产气荚膜梭菌产生α和β毒素，D型产气荚膜梭菌产生α和ε毒素，E型产气荚膜梭菌产生α和iota (ι，ITX)毒素[3]，F型产气荚膜梭菌产生α和enterotoxin (CPE) 毒素，G型产气荚膜梭菌产生α和necrotic B-like (NetB)毒素[4]。以往的研究发现A型产气荚膜梭菌是鸡坏死性肠炎的主要致病菌，少数为C型，但最近有学者表示真正可能致病的产气荚膜梭菌类型是G型[5-6]。

在过去40多年，使用抗生素类药物防治鸡坏死性肠炎取得了一定效果，但随之带来许多潜在危害，如细菌的耐药性逐渐增强，肉食品药物残留的超标等，成为严重威胁公众健康的公共卫生问题。为此，近年来西方一些发达国家已经明令禁止某些抗生素和动物促生长剂在畜禽养殖生产中的使用，而我国也明文规定截至2020年7月1日禁止饲料生产企业生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。这一系列减抗替抗政策的出台短期内将影响畜禽养殖业生产，一旦不提高养殖管理水平，一些肠道疫病，特别是由机会性致病原产气荚膜梭菌等引起的坏死性肠炎等疫病将难以控制，给家禽养殖业带来巨大经济损失[7]。如何寻找一种新的替代抗生素类的生物制剂来预防控制鸡坏死性肠炎疫病是一个迫在眉睫的任务，建立有效的发病模型来评价新型减抗替抗方案的防控效果即成为当前亟待解决的问题。然而由于目前对鸡坏死性肠炎的发病机制尚未完全清楚，且该病的发生又是一个多因素控制调节的疫病[8]，如何去复制一个有效的疫病发病模型是一个关键的难点，因此现对成功复制鸡坏死性肠炎病例的关键因素进行了详细的综述，以期为鸡坏死性肠炎病的实验室研究及综合防控提供理论基础。

1 鸡坏死性肠炎病例复制的关键因素

1.1 饲料因素以小麦、大麦或黑麦作为原材料的饲料中含有大量的水溶性难消化的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides,NSP)，这类物质能引起肠道消化液黏度和肠黏液的增加，消化液黏度的增加会延长肠道内容物的停滞时间，增加肠道内容物黏性以及产气荚膜梭菌的数量，可增加坏死性肠炎的发病率[9]。非烘烤大豆类的饲料能抑制胰蛋白酶活性进而增加坏死性肠炎对肠道的损伤[10]。

RODGERS等[11]研究表明，在动物饲料中添加鱼粉并不会增加艾美耳球虫与产气荚膜梭菌联合感染所引起鸡坏死性肠炎的严重性，但单独使用艾美耳球虫诱导或饲料添加鱼粉都会导致鸡群肠道菌群发生紊乱[12-13]，引起鸡坏死性肠炎的发生，因此无需同时使用球虫诱导和饲料添加鱼粉的方法进行鸡坏死性肠炎病例的复制。此外，限制鸡群的饲料摄入量会显著降低坏死性肠炎疫病引起的肠道症状的损伤评分[14]，因此在鸡坏死性肠炎病例复制模型的建立过程中，试验鸡群在饲养过程中需获得充足的饲料，避免限料。

1.2 菌株因素

1.2.1菌株毒素的类型 目前，基于试验研究，人们普遍认为只有具有netB基因阳性的G型产气荚膜梭菌菌株能引起鸡坏死性肠炎[15]。netB基因与一个位于质粒上的致病性位点(NELoc-1)相关[16]，研究人员发现在复制病例的过程中，netB基因会出现丢失，从而导致病例复制失败。造成netB基因丢失的原因主要有两个方面，一是其他基因在NELoc-1位点中发生突变，使调控基因发生变异，导致原始菌株中含有netB致病性位点的整个毒力质粒丢失；二是细菌在继代培养过程中，具有netB基因的质粒自行从宿主菌株中失去。可能的原因是netB具有独特的染色体基因[17]，当netB毒力质粒在宿主菌中表达时会对菌株产生消极的影响，宿主菌株因为自我保守机制对质粒进行了修改，从而导致netB毒素基因的自行丢失。因此，保证病例复制所使用的产气荚膜梭菌是含有netB毒素的G型菌对于试验的成功至关重要。

此外有研究报道，具有tpeL基因阳性的G型产气荚膜梭菌菌株中netB毒素基因的拷贝数远远大于tpeL基因阴性的G型产气荚膜梭菌[17]，即具有tpeL基因的G型产气荚膜梭菌比没有tpeL基因的菌株能引起更严重的鸡坏死性肠炎[18]，说明tpeL毒素是另一个引起鸡坏死性肠炎发病的重要毒素。

1.2.2菌株毒素制备方法 对于鸡坏死性肠炎病例的复制，G型产气荚膜梭菌菌株的制备非常重要。熟肉培养基与液体硫乙醇酸盐培养基(fluid thioglycollate medium，FTG)一样，在有氧培养条件下都可以支持产气荚膜梭菌的生长。研究发现菌株在FTG培养基中培养15 h后的致病力比培养24 h更强[19]，因此建议菌株在培养基中培养15 h后即可使用。菌株在有氧环境下培养15 h后，可以得到(2～5)×108个群落形成单位(CFU/mL)，健康鸡群中小肠每克肠道内容物中含产气荚膜梭菌的数量是102～104CFU/mL，而发生坏死性肠炎的鸡肠道中产气荚膜梭菌为 107～109CFU/mL；因此，菌株经FTG培养基培养15 h后得到的群落形成单位已经足以导致动物产生疫病[20]。

1.2.3菌株接种方法 使用已经制备好的G型产气荚膜梭菌接种动物时，普遍采用的接种方式有两种：一是通过拌料的方式对鸡群进行接种，即使用产气荚膜梭菌与培养基的混合物液体FTG和饲料以1.25～1.50∶1.00的比例(V∶W)均匀混合，鸡群在试验开始之前需要禁食一整夜，试验开始后，每天喂2次预先处理好的饲料，饲养周期一般为5 d，在接种饲料的最后一天或第2天对鸡只处理并进行病变评分的统计。通过饲料的方式对鸡群进行菌株接种虽然免去了每天对每只鸡进行单独接种菌株的麻烦，但需要大量的肉汤培养基，这可能会增加费用；二是通过口服或灌胃的方式接种经肉汤培养的菌株。具体方法是连续3 d，每天2次接种3 mL 105～107CFU/mL的菌液，或连续7 d每天接种1 mL(1～4)×108CFU/mL的菌液。该方法常与感染球虫、IBDV疫苗接种等有关鸡坏死性肠炎的危险因素相结合[21]。除了通过饲料或致病菌株直接灌胃感染以外，目前有研究人员选择将鸡群暴露在被产气荚膜梭菌污染的环境中进行自然感染[22]，虽然他们也取得不错的结果，但此种方法在不同群体间很难标准化，且重复性差，因此并不值得推广。

1.3 球虫感染因素球虫引起的肠道上皮损伤是鸡坏死性肠炎的主要诱发因素之一，产气荚膜梭菌之所以能够快速复制并分泌大量外毒素，可能是因为球虫感染造成鸡肠道黏膜损伤为产气荚膜梭菌提供了有利于菌株生长的大量氨基酸和富含蛋白质的营养，也可能是因为球虫病引起的肠黏液分泌异常有利于菌株的生长繁殖[21]。也有研究表明，由艾美耳属球虫感染(Eimeriaacervulina、E.brunetti、E.maxima的混合体)引起的肠道微生物菌群的显著变化是产气荚膜梭菌快速复制并产生毒素的促成因素[23]。由于以上这些原因，在试验诱导坏死性肠炎时艾美耳属球虫经常与产气荚膜梭菌联合使用。然而，球虫本身会对鸡群肠道产生严重的损害甚至导致其死亡，因此必须谨慎选择球虫种类和接种剂量。一般使用感染十二指肠的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)或感染小肠的巨型艾美耳球虫(E.maxima)进行球虫诱导试验。同时球虫的剂量也很重要，一般使用(2～5)×104E.acervulina或(2～5)×104E.maxima与产气荚膜梭菌联合诱发疫病。此外，球虫的感染时间对于成功诱导鸡群产生坏死性肠炎至关关键，一般不超过产气荚膜梭菌接种前4 d对鸡群接种球虫，以便球虫引起的肠道损伤与梭菌引起的症状同时发生。

1.4 实验动物因素

1.4.1实验动物免疫抑制 研究表明发生免疫抑制的鸡更容易发生坏死性肠炎，鸡群感染如传染性法氏囊病病毒、马立克病病毒、鸡白血病病毒等能引起机体的免疫抑制，从而造成鸡群坏死性肠炎发病率增高。因此有研究人员通过使用传染性法氏囊炎(infectious bursal disease,IBD)疫苗来提高坏死性肠炎病变的严重程度[24]，此方法通过对鸡只注射IBDV疫苗来完成。鸡只在注射IBDV疫苗后，由于免疫抑制的结果，发生坏死性肠炎时的症状会明显加重[25]。

1.4.2实验动物的品种、性别和日龄 不同种类的鸡对于鸡坏死性肠炎的发病率是不同的，Cobb鸡坏死性肠炎发病率明显高于Ross鸡或Hubbard鸡；不同性别、不同日龄的鸡对于坏死性肠炎的发病率也存在较大差异：生长速度较快的公鸡相较于母鸡更容易感染该病，14～20日龄的雏鸡体内不具有保护性的母源抗体，更容易暴发坏死性肠炎疫病[26]。

2 优化人工造模方法

鸡坏死性肠炎是一种复杂的多因素疫病，表1总结了一些能够引起动物发病的诱导因素[27-28]，在试验中可以通过人为控制其中的某些因素来调控诱导动物发病后产生症状的严重程度。

在进行动物试验攻毒阶段时试验人员可以选择使用哪些感染方式和感染途径对鸡群进行疫病的诱导感染，其中包括：单独使用具有致病性的含有netB毒素的G型产气荚膜梭菌通过灌胃或者掺拌饲料的方式进行给药(试验证明灌胃给药的途径最为快捷有效)感染鸡群，鸡群饲喂时饲料的选择可以参照表1中饲料因素罗列的能加重鸡坏死性肠炎的饲料进行选择(推荐使用高淀粉多糖的粉料饲喂鸡群)；另一种方法是使用球虫或者IBDV与产气荚膜梭菌联合使用[29]：在人工复制病例过程中，球虫的使用会明显加重疫病的严重程度[30]，但球虫的感染不是必需的，根据试验的目的可以选择用或者不用。不同试验目的所采取的具体方法和给药途径可能不同，这都取决于研究人员的预期目的以及现行可用的资源。

表1 鸡坏死性肠炎的诱导因素

3 鸡坏死性肠炎发病模型的评分系统

鸡坏死性肠炎病例复制试验中，对于鸡产生的坏死性肠炎进行病变评分是确定发病模型是否成功的关键，坏死性肠炎的大体病变包括多灶性至煤样化的黏膜纤维化至溃疡性病变，炎症引起的黏膜壁增厚和黏膜粘连渗出或黏膜脱落导致的黏膜壁变薄或平滑肌张力丧失，肠道伴有或不伴有气体膨胀，这些变化在严重程度上各不相同。在病变评分时，非常重要的一点是评估整个小肠的病变程度，因为病变可能只是局限于十二指肠，大多数最严重的病变出现在空肠，但在坏死性肠炎症状非常严重的情况下回肠也会受到影响。目前全球公认的坏死性肠炎病变评分系统：分别是0～6分制和0～4分制。0～6 分的评分系统具体评分细则，0分：无明显病变；1分：肠壁变薄或易碎；2分：1～5个局灶性坏死；3分： 6～15个局灶性坏死；4分：16个或 16个以上局灶性坏死；5分：2～3 cm的坏死区域；6分：广泛、 弥漫性坏死。此外0～4分评分系统评分细则，0分：无明显病变；0.5分：肠系膜及小肠壁严重充血；1 分：肠壁变薄、变脆，出血点多于5个；2分：肠腔内有气体，肠壁出现大量出血点并伴随少量坏死或溃疡点；3分：肠壁出现区域性坏死、溃疡；4 分：肠腔内有大量气体并出现弥漫性坏死。

为了试验组和对照组之间进行有意义的比较，任何评分系统都应该明确定义病变的严重程度和范围，其中必须考虑小肠受损的比例，并且无论该特定试验中最轻微和最严重的病变是什么，都必须严格按照病变评分系统对受损肠道进行评分。例如，有1 cm肠道发生了非常严重的病变，但在病变评分时具有这1 cm严重损伤的整个肠道不能被定义为具有严重的病变。

一些研究人员试图寻找免疫参数来显示对坏死性肠炎的严重性，例如，通过检测肠道黏膜中细胞因子如IL-8、IL-10和IFN-γ等炎性细胞因子水平的变化也可在一定程度上反映鸡坏死性肠炎的病变程度，但其结果在不同个体间差异很大，因此目前要用替代的、间接的系统来评估坏死性肠炎疫病的严重性，仍然需要很多年的时间。

4 小结及展望

4.1 饲料因素、菌株毒素类型、菌株培养、球虫诱导、实验动物等多种因素对人工造模的影响程度非淀粉多糖以及大豆类的饲料可以改变动物体内菌群的数量和消化酶的活性，增加禽类患坏死性肠炎的几率；G型产气荚膜梭菌是鸡坏死性肠炎的主要病原，能够引起鸡群暴发坏死性肠炎疫病；经FTG培养基培养15 h的G型产气荚膜梭菌具有最强的致病力，更容易导致鸡群发生坏死性肠炎；经球虫诱导后鸡群肠道发生损伤，致使鸡群肠道微生物发生变化，更有利于产气荚膜梭菌的生长，能够增大鸡群产生坏死性肠炎的几率；免疫抑制的鸡、Cobb鸡、公鸡以及不具有母源抗体的雏鸡更容易感染鸡坏死性肠炎病。

4.2 鸡坏死性肠炎动物发病模型能够成功建立需要注意的关键因素及优化方案菌株毒素类型和实验动物是鸡坏死性肠炎动物发病模型能够成功建立需要注意的最关键因素，建议在人工造模时优先选择netB阳性G型产气荚膜梭菌对SPF试验鸡进行动物试验，同时需要结合自身实验室情况对各种诱导因素进行筛选，选择最适合的条件进行试验。

4.3 改进鸡坏死性肠炎的病变评分系统建议实验人员选择整个小肠的病变程度进行鸡坏死性肠炎的病变评分，目前全球公认的坏死性肠炎病变评分系统：分别是0～6分制和0～4分制。同时需由多人进行病变评分，再对病变评分进行统计分析，由此得到的病变评分结果才更加具有准确性，才能使得复制鸡坏死性肠炎疫病能更容易成功，对进一步研究鸡坏死性肠炎疫病的病理以及分子机理，筛选有效预防和控制鸡坏死性肠炎的生物制剂具有积极意义。