刘丹华，张瑞莉，田 旭，吕晓萍，高雪丽，郑世民，刘超男

(东北农业大学 动物医学学院 黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

炎症是机体对各种生物、物理和化学刺激产生的病理反应[1]。当机体处于这种状态时，会产生大量的炎症因子如白细胞介素(interleukin ，IL)-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等，对机体造成严重的炎症损伤，从而给养殖业带来巨大的经济损失[2-3]。大量研究表明，IL-1β和TNF-α等炎性细胞因子的表达主要与NF-κBp65和p38MAPK信号通路的激活有关[4-5]。因而，抑制NF-κBp65和p38MAPK信号通路的活化成为抑制炎症发生发展的重要方向。细胞因子信号转导抑制因子(suppressers of cytokine signaling，SOCS)家族是一种负性调节蛋白，可能对NF-κBp65和p38MAPK的过度活化起到负反馈作用[6]。在炎症进程中，SOCS1和SOCS3能通过抑制TLR/NF-κB信号通路的活化发挥抗炎作用[7-8]，但是SOCS3在禽类相关疾病炎症进程中的抗炎作用及其机制仍不明确。

黄芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)是黄芪发挥药效的主要生物活性物质，具有抑制炎症、提高免疫、抑制肿瘤等多重生物学功能[9]。本研究旨在探索APS在LPS诱导的鸡胚成纤维细胞系(chicken embryo fibroblasts，DF-1)炎症反应中对促炎因子IL-1β和TNF-α表达的影响以及APS能否通过SOCS3对炎症信号NF-κBp65和p38MAPK的活化起到调控作用，进而为阐明APS抑炎机制提供可靠的理论依据，为家禽免疫应激性疾病的防治提供临床应用依据。

1 材料与方法

1.1 APS和DF-1细胞系APS由东北农业大学中兽医教研室赠送，采取Sevag法进行制备，APS含量以葡萄糖(C6H12O6)计，经苯酚-硫酸法绘制糖含量标准曲线后测定APS相对含量为87.5%[10]。DF-1细胞系由东北农业大学病理生理教研室保存备用。

1.2 主要试剂及仪器兔抗NF-κBp65、P-NF-κBp65(Ser 536)、p38MAPK、P-p38MAPK(Thr180/Tyr182)和SOCS3抗体购自英国Abcam公司；鼠抗α-Tubulin和酶标二抗购自碧云天生物有限公司；LPS(大肠杆菌O55:B5)和CCK8试剂盒购自美国Sigma公司；DMEM培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司。

二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；Biometra TONE PCR仪(德国耶拿公司)；Light Cycler®480R(美国Roche公司)；Mini-PROTEAN Tetra System(美国BIO-RAD公司)；5430R低温离心机(德国 Eppendorf 公司)。

1.3 LPS和APS应用质量浓度的选择DF-1细胞在DMEM(10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素)完全培养液中于5%CO2、37℃条件下培养。当细胞密度约80%时分别加入不同质量浓度的LPS[11](0.0,0.5,2.0,8.0,32.0 mg/L)培养24 h后检测不同质量浓度组DF-1细胞活力和IL-1β mRNA表达量变化，选择能引起免疫应激炎症反应时LPS的最适质量浓度。同样，将不同质量浓度APS[12](0，20，100，200，500 mg/L)预处理DF-1细胞后，再加入上述最适应用质量浓度的LPS共培养24 h，分别检测各组IL-1β mRNA表达量变化以及细胞活力(按CCK8试剂盒说明检测样品在450 nm处的吸光度)，以确定APS的最适应用质量浓度。

1.4 试验分组及处理将生长状态良好的DF-1细胞接种于12孔板(1.25×105/孔)和6孔板(2.5×105/孔)中，待细胞密度约80%时将其分为对照组(C)、LPS组(L)、APS组(A)和APS +LPS组(A+L)共4组，每组设置3个复孔。A组和A+L组首先加入APS，使其终质量浓度为100 mg/L(L组和C组则分别加入相同体积无血清DMEM)预处理2 h。随后，L组和A+L组加入LPS，使其质量终浓度为2 mg/L(C组和A组则加入相同体积无血清DMEM)，继续培养6,12,24,48,72 h并收集样本。

1.5 RT-PCR法检测NF-κB和MAPK及其通路相关因子mRNA表达量将12孔细胞培养板内的DF-1细胞根据TRIzol使用说明提取总RNA，依据PrimeScriptTMRT试剂盒的说明合成cDNA。用DNAStar与Primer 5.0软件设计引物，IL-1β、TNF-α、NF-κBp65、p38MAPK、SOCS3和β-actin具体引物序列见表1。β-actin为内参基因，所有引物均由上海生物工程有限公司合成。各组设置3个复孔，同时设立空白对照。记录各孔Ct值，并采用2-ΔΔCt法对结果进行分析。

表1 RT-PCR所用引物序列信息

1.6 ELISA法检测相关炎性因子蛋白含量在加入LPS后不同时间点，收集各处理组细胞上清液，5 000 r/m离心10 min，去除沉淀，分别按IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒说明书进行相关操作。每个样本设3个重复，同时设定空白孔。以空白孔调零，测定样品在450 nm波长时的吸光度。

1.7 Western blot法检测NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3蛋白含量在加入LPS继续培养24 h后，弃去6孔细胞培养板内培养液，加入RIPA裂解液(裂解液中含10%PMSF和磷酸酶抑制剂)提取总蛋白，将蛋白煮沸变性后于10% SDS-PAGE凝胶电泳，常规转印、封闭等操作后在NC膜上分别加入相应浓度的抗NF-κBp65、P-NF-κBp65(Ser 536)、p38MAPK、P-p38MAPK (Thr180/Tyr182)、SOCS 3和α-Tubulin的抗体于4℃孵育过夜，洗涤后再加入HRP偶联二抗在室温摇床孵育1 h，后经ECL化学发光处理。

2 结果

2.1 LPS和APS质量浓度的选择由图1A可知，LPS质量浓度在0.0～0.5 mg/L时，其质量浓度的增加对DF-1细胞活力稍有增加，但无统计学差异(P>0.05)；当LPS质量浓度在2.0～32.0 mg/L时，DF-1细胞活力显著降低(P<0.05)，且有剂量依赖性。由图1B可知，LPS质量浓度在0.5～32.0 mg/L时，DF-1细胞IL-1β mRNA表达量显著高于对照组(P<0.05)，可知在此质量浓度范围内LPS均可诱导DF-1细胞产生炎症反应。其中LPS在2.0～32.0 mg/L时炎性因子表达量之间无显著性差异(P>0.05)，因此确定2.0 mg/L作为本研究LPS最适质量浓度。由图1D结果发现，在LPS刺激24 h后，APS质量浓度在100～200 mg/L时细胞活力无明显差异，前者略高于后者，但两者均显著高于20，500 mg/L组(P<0.05)；由图1C可以看出，在LPS刺激24 h后，APS质量浓度在100～500 mg/L时，DF-1细胞IL-1β mRNA表达量显著低于0～20 mg/L APS组(P<0.05)，且100～200 mg/L组间无显著性差异(P>0.05)，由此本研究选择的APS最佳应用质量浓度为100 mg/L。

2.2 不同处理组DF-1细胞IL-1β和TNF-α mRNA表达量的变化结果表明，L组DF-1细胞IL-1β和TNF-α(图2) mRNA表达量在6～72 h都显著高于C组(P<0.05)；A组IL-1β和TNF-α mRNA表达量较C组显著升高(P<0.05)，但不同程度低于L组。与L组相比，A+L组IL-1β和TNF-α mRNA表达量分别在6～72,12～72 h时显著降低(P<0.05)。

注：*与对照组相比P<0.05；#与LPS组相比P<0.05；无标号者P>0.05。下同

C.对照组；L.LPS组；A.APS组；A+L.APS+LPS组

2.3 不同处理组DF-1细胞NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3 mRNA表达量的变化由数据可知，L组NF-κBp65(图3A)mRNA表达量在LPS刺激后6～72 h时显著高于C组(P<0.05)；A组NF-κBp65和SOCS3(图3C)mRNA表达量在6～72 h时均显著高于C组(P<0.05)。与L组相比，A+L组NF-κBp65 mRNA表达量分别在6～72 h时显著降低(P<0.05)，SOCS3 mRNA表达量在6～72 h时显著升高(P<0.05)；其他时间点各因子变化不显著(P>0.05)。

2.4 不同处理组DF-1细胞IL-1β和TNF-α蛋白含量的变化结果表明，L组DF-1细胞IL-1β(图4A)和TNF-α(图4B)蛋白含量在6～72 h时都显著高于C组(P<0.05)；A组IL-1β和TNF-α蛋白含量较C组显著升高(P<0.05)，但又不同程度低于L组。与L组相比，A+L组IL-1β和TNF-α蛋白含量分别在12～72,6～72 h时显著降低(P<0.05)，其他时间点也稍有降低，但统计学上差异不显著(P>0.05)。

图3 不同处理组DF-1细胞NF-κBp65(A)、p38MAPK(B)和SOCS3(C)mRNA表达量的变化

图4 不同处理组DF-1细胞IL-1β(A)和TNF-α(B)蛋白含量的变化

2.5 不同处理组DF-1细胞NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3 蛋白含量的变化结果表明，L组和A组DF-1细胞P-NF-κBp65/NF-κBp65(图5A)比值显著高于C组(P<0.05)，A+L组P-NF-κBp65/NF-κBp65比值显著低于L组(P<0.05)；A组SOCS3(图5C)蛋白含量显著高于C组(P<0.05)，A+L组SOCS3蛋白含量显著高于L组(P<0.05)；各处理组间P-p38MAPK/p38MAPK(图5B)比值变化无统计学差异(P>0.05)。

图5 不同处理组DF-1细胞P-NF-κBp65/NF-κBp65(A)、P-p38MAPK/p38MAPK(B)和SOCS3/α-Tubulin(C)蛋白含量

3 讨 论

APS是黄芪发挥抑炎作用的主要生物活性成分，是从黄芪根部提取并纯化的水溶性淡黄色均质粉末，无特殊气味，不易产生耐药性，无毒副作用，不影响细胞正常生命活动，可以作为免疫增强剂来提高机体免疫水平，达到预防和治疗的双重作用效果[13]。在体外条件下，APS能促进鼠巨噬细胞活化并诱导大量的炎症因子如TNF-α、IL-6等的产生，具有免疫调节和抗肿瘤的双重作用[12]。体内试验表明，连续灌服不同剂量APS组大鼠抗体生成水平明显升高，T淋巴细胞亚群失衡现象得到改善，机体免疫水平明显提高[14]。本研究发现，APS处理组IL-1β和TNF-α在转录与翻译水平都明显升高，提示APS可通过促进DF-1细胞炎性因子的释放起到增强免疫的效果。在LPS诱导免疫应激炎症模型中，LPS与细胞膜表面模式识别受体TLR4结合，通过MyD88依赖途径直接促进NF-κB入核，进一步加强炎性因子IL-1β和TNF-α等的释放，进而引起炎症损伤。研究发现，在LPS刺激的肠上皮细胞炎症模型中，APS预处理可以显著降低细胞炎症因子IL-1β、TNF-α的表达，这些结果均表明APS作为抗炎药物在免疫应激类疾病中的可靠用途[15]。在本研究中，APS预处理可以显著抑制LPS引起的上述损伤作用，表明APS在一定范围内促进炎性因子产生达到增强机体免疫功能的同时，又可通过某种负反馈调节机制抑制炎性因子的过度表达，进而限制机体的过度炎症反应。

大量证据表明，NF-κB和p38MAPK参与多种促炎因子的产生与释放[16-17]。通常情况下，NF-κB与抑制蛋白IκB结合处于无活性状态，只有磷酸化后入核才能发挥相应的免疫功能[18]。本研究发现，APS可以促进DF-1细胞中NF-κBp65炎症信号的活化，进一步增强下游炎性因子IL-1β和TNF-α的释放，发挥免疫增强作用。HE等[19]和WEI等[12]研究证实，APS的核心免疫激活结构可与TLR4结合，少量的APS处理可刺激NF-κB的活化，使巨噬细胞释放大量炎症因子从而发挥免疫调节作用。而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族是一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在多种免疫细胞内参与炎症反应、细胞生长、分化等过程。YAO等[20]指出，抑制巨噬细胞中MAPKs的活化可显著降低细胞中促炎细胞因子的表达。然而在DF-1细胞中，本研究发现各处理组间p38MAPK mRNA的表达以及蛋白磷酸化水平均无显著性差异，提示在DF-1细胞中由LPS刺激引起的炎症反应并不通过p38MAPK信号通路，而是主要依赖NF-κBp65信号通路介导，其具体机制仍需进一步探索。

细胞因子信号通路抑制因子(SOCS)蛋白家族是近年来发现的受细胞因子诱导的蛋白质家族，SOCS3 是该家族重要成员之一。SOCS自1997年发现以来一直被认为是JAK/STAT信号通路的负反馈调节蛋白[21]。近年来的研究发现，SOCS蛋白在NF-κB信号通路中发挥着重要的调节作用[22]。有研究表明，在哺乳动物细胞中异常高表达的SOCS3蛋白可通过与TRAF2相互作用抑制NF-κB信号通路的激活，降低促炎因子的产生水平；通过抑制SOCS3的表达，进一步印证了SOCS3蛋白对NF-κB信号通路的抑制作用[23]。本研究中，APS组SOCS3的表达显著高于对照组，提示APS处理可能通过高表达SOCS3来调节NF-κBp65的活化，使炎性因子IL-1β和TNF-α产生的量既能增强免疫又不至损伤机体；APS+LPS组与LPS组相比，SOCS3的表达显著升高，NF-κBp65磷酸化水平明显降低。由此推测，经APS预处理的DF-1细胞再受到LPS刺激时，预先激活的SOCS3可能通过抑制NF-κBp65炎症信号通路的活化，进一步抑制炎性因子IL-1β和TNF-α的释放而发挥抑炎作用，以保护机体免受炎症损伤。

因此，在DF-1细胞中，APS单独处理可以促进IL-1β和TNF-α等细胞因子的释放而发挥免疫增强作用；而在LPS诱导的禽DF-1细胞炎症模型中，APS预处理能通过SOCS3的高表达来抑制NF-κBp65的过度活化，降低炎性细胞因子IL-1β和TNF-α的释放，从而发挥抑制炎症的作用。