贡 嘎，格桑卓玛，左 伟，罗润波，索朗斯珠*

(1.西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；2．西藏自治区动物疫病预防控制中心，西藏 拉萨 850000)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)属于肠杆菌科克雷伯杆菌属，不仅广泛存在于自然界中，在人和动物的消化道、呼吸道和皮肤等部位均有分布，主要使人和动物引发肺炎、细菌性肝脓肿、泌尿系统感染、败血症和外伤性感染等[1-3]。

目前，肺炎克雷伯菌已成为除大肠杆菌外的第二大条件致病菌。在我国台湾地区及其他多个国家，由肺炎克雷伯菌引发的化脓性肝脓肿并发眼内炎或脑膜炎频繁发生[4-7]。据报道，该菌毒力因子主要有K抗原(荚膜多糖)、脂多糖(O 抗原脂多糖)和Ⅰ型菌毛等[8-12]，且荚膜多糖是重要的毒力因子之一。迄今为止肺炎克雷伯菌存在至少82 种荚膜多糖血清型[13-14]，其中K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57 和 KN1 被认为是强毒力血清型[15-16]。

牛感染此菌主要引起牛上呼吸道感染和奶牛乳房炎等。在国外，KATSANDE等[17]和ASLAN等[18]报道,肺炎克雷伯菌在奶牛乳腺炎和牛上呼吸道感染细菌病原中分别占15.5%，20.0%；在国内，许惠[19]2012年证实肺炎克雷伯菌可引起牛发病，且表现出严重的呼吸道感染症状及重症肺炎等。随后，王乐等[20]和葛东红等[21]报道陕西、江苏等地都有肺炎克雷伯菌在奶牛中流行。刀丽梅等[22]报道，牛源肺炎克雷伯菌在重庆和四川地区流行。隋明等[23]在2019年对四川地区牦牛源肺炎克雷伯菌进行了分离鉴定及耐药性分析。西藏是我国五大牧区之一，牦牛是主要的支柱产业之一，其提供的产品对当地牧民的衣食住行等方面起着重要的作用。随着牦牛养殖数量的增加，关于牦牛相关疾病的报道逐渐增多。但目前尚未见有关西藏牦牛源肺炎克雷伯菌的报道。本试验从西藏拉萨市、林芝市、那曲市等不同牦牛养殖户采集了103 份患呼吸道疾病牦牛鼻拭子样品，分离鉴定肺炎克雷伯菌，并对其进行荚膜血清分型、毒力基因、耐药表型和耐药基因的检测，为牦牛源肺炎克雷伯菌的进一步研究及防制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 病料采集从西藏拉萨市、林芝市、那曲市牦牛养殖户采集患有呼吸道疾病牦牛鼻拭子103 份样品(其中拉萨市30 份、那曲市30 份、林芝市43 份)进行细菌分离鉴定。患病牦牛均出现呼吸急促、食欲减退、咳嗽等症状，并有大量的脓性鼻分泌物。

1.2 实验动物5周龄SPF级BALB/c小鼠10 只，购自北京维通利华实验动物中心，体质量约17 g。

1.3 主要试剂哥伦比亚血平板购自江门市凯林贸易有限公司；胎牛血清购自青岛中创生物科技有限公司；Taq DNA聚合酶、PCR试剂、核酸染料Gel View、克隆载体pMD18-T等购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、LB培养基均购自上海生工。

1.4 药敏纸片青霉素、头孢氨苄、头孢曲松、新霉素、苯唑西林、四环素、氨苄西林、多西环素、庆大霉素、米诺环素、哌拉西林、卡那霉素、红霉素、环丙沙星、诺氟沙星和氧氟沙星药敏纸片，共13 种，购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.5 细菌的分离培养及纯培养将鼻拭子划线接种于哥伦比亚血平板上，37℃培养18～24 h，观察细菌生长情况，挑取单个菌落进行纯培养。

1.6 分离菌的生化鉴定挑取纯培养单菌落，制备菌株悬液，并利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定。

1.7 动物致病性试验选取所分离获得的牦牛源克雷伯菌菌株，接种营养肉汤培养基，37℃振荡培养24～48 h，4 000 r/min离心20 min，用灭菌生理盐水调整含菌量为104CFU/mL的悬浮液，作为攻毒用菌液。分别以0.2 mL/只腹腔接种试验小鼠5只，同时以相同剂量营养肉汤按相同途径接种试验小鼠5只作为空白对照，接种后隔离饲养观察，记录试验小鼠死亡情况。剖检观察死亡小鼠组织病变，并从死亡小鼠组织中分离回收攻毒菌。

1.8 16S rDNA及系统发育树的构建提取细菌基因组DNA，根据文献[20]中报道的16S rDNA通用引物，进行PCR鉴定，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，并回收目的基因进行克隆；PCR检测阳性的菌液送去测序，测序结果用NCBI数据库进行BLAST比对。选取部分序列，采用MEGA 7.0法构建系统进化树。

1.9 特异性基因鉴定根据文献[20]中报道的肺炎克雷伯菌特异性引物：5′-TGATTGCATTCGCC-ACTGG-3′；5′-GGTCAACCCAACGATCCTG-3′，进行PCR扩增，扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.10 K血清型PCR检测选择流行广泛的荚膜血清型，参考文献[24]采用PCR扩增方法对分离株进行分型检测，引物序列见表1。

表1 血清分型PCR引物参数

1.11 毒力基因检测选择文献中报道较多且与其致病性关系密切的毒力基因mrkD、fimH和wabG，参考文献[25]采用PCR扩增的方法进行检测，引物序列见表2。

表2 毒力基因PCR引物参数

1.12 耐药基因检测选择6类16种耐药基因，参考文献[26]采用PCR扩增方法进行检测，引物序列见表3。

表3 耐药基因引物参数

续表3

1.13 药敏试验无菌操作选取分离细菌纯培养物致密划线于普通营养琼脂平板上，将临床常用的16种抗生素药敏纸片贴于琼脂平板表面中央处，倒置平皿，放于37℃培养箱中培养24 h 后观察结果。参照 NCCLS(2013)公布的标准以敏感(susceptible)、中介(intermediate)和耐药(resistant)3种形式对抑菌圈直径大小做出判定，个别抑菌圈直径大小参考相关文献做出判定[27]。

2 结果

2.1 细菌的分离纯化从所采集的103 份样品中，分离到8 株疑似肺炎克雷伯菌株。分离菌株在哥伦比亚血平板血琼脂培养基上形成光滑、湿润、边缘整齐黏液状菌落。革兰染色后镜检为G-(图1)。

图1 分离菌革兰染色镜检结果

2.2 生化鉴定结果8株分离菌株能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、鼠李糖、海藻糖，甘露醇、阿拉伯醇、山梨醇、吲哚呈阳性，而肌醇、精氨酸双水解酶呈阴性，不产生H2S，与肺炎克雷伯菌生化特性基本一致，均疑似为肺炎克雷伯菌。

2.3 动物致病性试验将分离的菌株制成悬浮液，腹腔接种试验小鼠，结果从接种后3 d开始，试验小鼠出现死亡现象，且病死率达80%(4/5)。对死亡小鼠进行尸检发现，其脾脏具有明显的肿大现象。并且成功从死亡小鼠脾脏中分离到克雷伯菌，经PCR鉴定与所分离出的菌株与攻毒菌株一致。对照组小鼠仍存活。

2.4 16S rDNA及系统发育树的构建采用PCR方法进行16S rDNA检测，扩增出约1 400 bp条带，与目标条带片段大小一致，鉴定结果见图2。不同地区肺炎克雷伯菌检出率结果见图3，总检出率7.76%(8/103)，其中拉萨市检出率0.00%(0/30)，那曲市检出率6.67%(2/30)，林芝市检出率最高达13.90%(6/43)。对测序结果进行比对后构建进化树，结果西藏牦牛源分离菌株与重庆牛源KM096433和北京土壤源JQ003560聚为一簇，表明与KM096433和JQ003560亲缘关系最近,但与沃尔巴克菌不在同一分支上，结果见图4。

M.DL2000 DNA Marker；1～9.样品编号

图3 不同地区肺炎克雷伯菌检出率

图4 牦牛源肺炎克雷菌16S rDNA基因序列构建的系统发育树

2.5 特异性基因(Khe)鉴定采用PCR方法检测肺炎克雷伯菌特异性基因，扩增结果显示出现1条约430 bp特异性条带，与目标条带片段大小一致，鉴定结果见图5，确定为肺炎克雷伯菌。

M.DL2000 DNA Marker；1～5.样品编号

2.6 K血清型PCR检测通过PCR方法对主要流行的肺炎克雷伯菌血清型K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57进行检测，获得血清型特异性基因大小为741 bp(图6)，与肺炎克雷伯菌血清型K20特异性基因的大小一致，说明本次分离所得的西藏牦牛源8株克雷伯菌均为K20型。

M.DL2000 DNA Marker；K1、K2、K3、K5、K20、K54、K57.血清型编号

2.7 毒力基因检测采用PCR方法对肺炎克雷伯菌 3种毒力基因mrkD、fimH和wabG进行检测，结果显示3种毒力基因在8株西藏牦牛源肺炎克雷伯菌分离菌株中检出率为100%(图7)。

M.DL2000 DNA Marker；1.mrkD基因；2.fimH基因；3.wabG基因

2.8 耐药基因检测采用PCR技术对8株牦牛源肺炎克雷伯菌临床分离菌株进行6类12种耐药基因的检测(图8)。结果显示，林芝市分离的6株菌株对4类药物产生耐药，分别为四环素类、大环内酯类、碳青霉素类和磺胺类，耐药基因分别为tetA、blaTEM、blashva-1和sul3。那曲市分离的2株菌株对2类药物产生耐药，分别为碳青霉素类和磺胺类，耐药基因分别为blaTEM和sul3。其中，blaTEM和sul3两种耐药基因检出率100%，其余耐药基因均未检出。

2.9 药敏试验

2.9.1西藏牦牛源克雷伯菌耐药情况 西藏林芝市和那曲市的8株牦牛源克雷伯菌对13种常用抗菌药物有不同程度的耐药性，结果详见表4和图9。

2.9.28株耐药菌株的耐药谱 8株西藏牦牛源耐药克雷伯菌对13种抗菌药物有不同程度的耐药性，且出现多重耐药现象，最多为9种，最少为2种。9耐菌株所占总菌株比例最大为37.5%，其次是2耐为25%，8耐、7耐和6耐均为12.5%。

M.DL2000 DNA Marker；1～12.耐药基因(yrB、gvrA、sul3、sul2、sul1、aadA1、BlaROB-1、blaSHV-1、blaTEM、ermF、tetA、tetD)

表4 8株牦牛源肺炎克雷伯菌的药敏试验结果(抑菌圈直径) mm

图9 西藏牦牛克雷伯菌对13种抗菌药的耐药率

3 讨论

自肺炎克雷伯菌首次从患有大叶性肺炎病人的肺脏组织中分离培养后，国内外学者相继从牛、羊、鸡、兔、猪等多种畜禽体内分离出肺炎克雷伯菌并对其进行相关研究[28]。近年来，由于抗生素的广泛使用导致克雷伯菌耐药现象越来越严重，严重影响畜禽，尤其是毛皮动物等养殖业发展。

本研究从西藏那曲市、拉萨市和林芝市牦牛养殖户患有呼吸道症状的牦牛病料中进行病原菌的分离，对所分离的菌株进行生化特性、16S rDNA及特异性基因鉴定，并对16S rDNA基因进行序列分析，同时对分离菌株进行荚膜血清分型、毒力基因、耐药基因和耐药性分析研究。结果从所采集的103份鼻拭子中成功分离出8株克雷伯菌，其中林芝市分离率最高达13.9%，其次是那曲市为6.67%，拉萨市未分离到。分离的8株菌株均发酵各种糖类，不产生H2S，与牛源肺炎克雷伯菌生化特性基本一致。此外，分离菌经PCR扩增出430 bp的特异性基因(Khe)，进一步验证了分离菌为肺炎克雷伯菌。16S rDNA序列进化分析显示，西藏牦牛源分离菌株与肺炎克雷伯菌同源性达97%，其中与KM096433和JQ003560聚为一簇，其亲缘关系最近。

肺炎克雷伯菌的菌体表面有大量的荚膜多糖，能够使菌体抵抗宿主细胞的吞噬能力[29]。根据荚膜多糖(K)分型，目前主要有K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57等。据报道[30]，K1和K2型为毒力最强的血清型。本次从西藏牦牛呼吸道病料中分离的8株菌株均为K20血清型。

有文献报道[31]，肺炎克雷伯菌多种毒力基因中mrkD、fimH和wabG非常保守且具有高度同源性，说明这3种毒力基因是重要的致病因子。本试验对所分离的8株菌株进行mrkD、fimH和wabG这3种重要毒力基因检测，发现8株菌株均可检测到3种毒力基因，说明流行在西藏牦牛群中的肺炎克雷伯菌对牦牛具有一定的致病性，需要引起注意。

此外肺炎克雷伯菌对多种常用抗菌药物表现多重耐药[32]。本试验对分离的8株菌株进行大环内酯类、磺胺类、四环素类、链霉素类、喹诺酮类、碳青霉烯类等6类耐药基因进行检测，结果显示林芝市检出4类耐药基因，分别为四环素类、大环内酯类、碳青霉素类和磺胺类，耐药基因分别为tetA、blaTEM、blashva-1和sul3。那曲市检出2类耐药基因，分别为碳青霉素类和磺胺类，耐药基因分别为blaTEM和sul3，其余的耐药基因均未检出。13种常用抗菌药物耐药表型检测结果显示，西藏牦牛源肺炎克雷伯菌具有较高的耐药性，对青霉素和氨苄西林耐药率达100%，其次是克拉霉素、四环素和多西环素耐药率达75%，与检出的耐药基因结果基本一致。而分离菌株对喹诺酮类药物，如：环丙沙星、氧氟沙星和诺氟沙星强敏感，这与喹诺酮类耐药基因检测结果也完全一致。在这些耐药菌株中，多重耐药现象也较严重，耐药谱集中在 2～9 耐，其中 9耐居多，其次是2耐和7 耐菌株，分别占总菌株的37.5%，25.0%，12.5%。 隋明等[23]对四川地区牦牛克雷伯菌的耐药情况进行检测，结果显示对氨苄西林、阿莫西林、多西环素等药物耐药率较高；最高达90.70%，且耐9，10种药物的菌株居多。此外，耐药基因检测结果中blashva-1、blaSHV、sul2、sul3和floR5基因的检出率较高，这与本次耐药及耐药基因检测结果基本一致，说明高原地区牦牛克雷伯菌耐药现象呈相同趋势，且说明单一菌株携带多种抗生素耐药基因的情况越来越常见。韩坤等[33]对山东省貂源肺炎克雷伯菌进行耐药性分析发现，分离菌对喹诺酮类耐药性较高；此研究结果与本试验结果存在一定的差异，这可能与感染的宿主不同所致。

综上所述，肺炎克雷伯菌在西藏牦牛中存在一定的流行趋势，且其耐药率及多重耐药现象越来越严重，说明今后在用药时务必要根据药敏试验结果，有针对性地使用，还应考虑采取联合用药、交叉或轮换用药等方法，杜绝滥用抗菌药物，相关部门也需要加强管理，控制疫情的流行与暴发。