巩雪峰，李 红，宋占锋，贺 康，许 艺，陈 鑫，闫志英，刘独臣，严奉军

(1 四川省农业科学院 园艺研究所/蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室，四川 成都 610066；2 农业农村部 西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，四川 成都 610066；3成都市种子管理站，四川 成都610072；4中国科学院 成都生物研究所，四川 成都 610041)

农业生产中，由于磷肥、农药的大量施用及污水灌溉，加之矿产资源的不合理开发、工业建筑垃圾乱堆乱放以及大气沉降等原因，世界许多地方的农业土壤都受到重金属，如Cd、Cu、Zn、Ni、Co、Cr、Pb和As的污染[1]。中国重金属超标耕地高达232万hm2，占总耕地面积的19.4%，其中Cd污染土壤占比高达7.0%[2]。Cd是无生物功能的金属元素，即使较低浓度都会对植物造成毒害，导致植物生长缓慢，叶片发黄失绿，产量降低[3]。同时，Cd毒性高、移动性强，在土壤中无法被生物降解，极易被植物吸收并转运至可食用部位，若通过食物链进入人体会引发多种疾病，严重威胁着人体健康[4]。研究表明，人体内绝大多数Cd来源于食物，尤其是蔬菜[5]，因此有必要采取有效措施来保护蔬菜免受Cd的污染。

γ-聚谷氨酸(γ-poly glutamic acid，γ-PGA)是D-谷氨酸和L-谷氨酸通过微生物发酵后由γ-谷氨酰胺键连接而成的高分子聚合体，具有强螯合性、生物可降解性和环境友好性等特点，已广泛应用于医药、食品、化妆品及环保等行业，在农业方面的应用相对较晚[6]。研究发现，γ-PGA可以促进植物养分吸收，从而促进植物生长[7]。此外，γ-PGA可通过参与水稻幼苗的渗透调节而提高其抗旱能力[8]，可以增强甘蓝型油菜脯氨酸积累，从而影响其对盐和冷胁迫的耐受性[9]。Pang等[10]报道，γ-PGA可以有效缓解Cd和Pb对黄瓜幼苗生长的抑制，降低黄瓜幼苗对Cd和Pb的吸收。考虑到γ-PGA的侧链含有大量羧基，具有很强的金属螯合能力，因此可能成为理想的稳定剂[11]，在蔬菜Cd污染治理上具有广阔的应用前景。

辣椒(CapsicumannuumL.)是我国重要的经济作物，全国各地均有广泛种植。但土壤Cd污染会抑制辣椒生长，Cd超标不仅降低其品质，而且会影响人体健康[12]。目前利用γ-PGA来缓解辣椒Cd胁迫、抑制辣椒Cd吸收的研究还鲜见报道。为此，本研究分别利用水培和盆栽的方式，分析叶片喷施γ-PGA对辣椒幼苗期生长和成熟期果实产量等的影响；同时利用水培法模拟Cd污染条件，分析叶片喷施γ-PGA对辣椒Cd吸收的影响，以期为辣椒安全生产及蔬菜的Cd污染防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及育苗

供试辣椒(CapsicumannuumL.)品种川腾6号，为四川省农业科学院园艺所自育品种；γ-PGA由中国科学院成都生物研究所闫志英研究员课题组提供。试验于四川省农业科学院园艺研究所光照温室进行，培养条件如下：平均温度25 ℃/18 ℃(昼/夜)，相对湿度60%，采用T5全光谱荧光灯(上海鼎铎)为光源，光照强度300 μmol/(m2·s)，光周期16 h/8 h(昼/夜)。供试辣椒幼苗分2批进行培育，选取饱满的辣椒种子，用体积分数10% H2O2消毒10 min，28 ℃黑暗中催芽，待根长至2～3 cm后移至装有改良Hoagland’s营养液[13]的试管(50 mL)中，待辣椒幼苗长至6叶1心时完成育苗工作。

1.2 试验处理

1.2.1 γ-PGA对辣椒生长及果实产量的影响 选取第1批长势一致的6叶1心供试辣椒幼苗，一部分移栽至装有20 L改良Hoagland’s营养液的水培箱(长×宽×高=44 cm×24.3 cm×29.8 cm)中培养，营养液每7 d更换1次，每箱栽培辣椒8株，幼苗自移栽后每隔10 d取样测定植株鲜质量，共测6次。其余幼苗移栽至装有基质的塑料花盆(外径×高=17.3 cm×10.3 cm)中，基质由珍珠岩/腐殖土按质量比1∶4组配而成，经高温灭菌后称质量，使每盆质量保持一致，每盆栽辣椒1株, 并用改良Hoagland’s营养液浇灌；至果实成熟后测定果实结果数量、单果质量、产量、果实长度等指标。水培和盆栽苗自移栽后，各栽培方式的1/2幼苗于叶面喷施蒸馏水(对照)，另外1/2幼苗叶面喷施0.1 g/L的γ-PGA，每隔5 d喷施1次，以叶面和叶背滴水为宜(约10 mL/株)，每处理重复3次。对测定数据进行统计分析，确定γ-PGA对辣椒的作用后进行后续试验。

1.2.2 γ-PGA对镉胁迫辣椒生理特性的影响 选取第2批长势一致的6叶1心供试辣椒幼苗，移栽至水培箱中，7 d后对1/2幼苗叶面喷施0.1 g/L的γ-PGA，另外1/2幼苗喷施蒸馏水作为对照，每5 d喷施1次，共喷施2次，喷施方式同上。第2次喷施完成后，以CdCl2·2.5H2O形式向改良Hoagland’s营养液中加入Cd进行Cd胁迫试验。试验共6个处理：加入不含Cd的营养液(Cd0)；加入不含Cd的营养液，但叶面喷施0.1 g/L γ-PGA(Cd0+PGA)；加入含5 mg/L Cd的营养液(Cd5)；加入含5 mg/L Cd的营养液，同时叶面喷施0.1 g/L γ-PGA(Cd5+PGA)；加入含10 mg/L Cd的营养液(Cd10)；加入含10 mg/L Cd的营养液，同时叶面喷施0.1 g/L γ-PGA(Cd10+PGA)。每个处理重复3次，每7 d更换1次营养液。Cd胁迫试验5 d后进行辣椒生长及生理指标的测定。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 幼苗生长及果实产量 将第1批供试幼苗的水培辣椒按1.2.1节所设定的间隔周期小心取出，纸巾拭去根部表面的水分，用电子天平测定植株鲜质量；第1批供试幼苗的盆栽辣椒待果实成熟后，用游标卡尺测定果实长度，电子天平测定果实单果质量，记录每株植株结果数量及收果时间(d)，单株产量=平均单果质量×单株结果数。对第2批供试水培辣椒，用毫米刻度尺测定株高，并计算生长速率：植株生长速率=(镉处理后株高-镉处理前株高)/镉处理时间。

1.3.2 叶绿素含量 第2批供试各处理水培辣椒自顶向下取第3～4片成熟叶片，去除叶脉后剪碎混匀，取0.20 g鲜叶，放入50 mL离心管中，加入20 mL体积分数80%丙酮，密封后于室温下避光浸提24 h，其间摇动3～4次，待叶片完全变白后取上清液，用紫外分光光度计测定645和663 nm的吸光度值，计算叶绿素含量[14]。

1.3.3 抗氧化物酶活性 逆境胁迫条件下，植物为减少活性氧(ROS)代谢导致的伤害，其自身抗氧化物酶系统中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、过氧化物酶(peroxidase,POD)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)等均会有所响应。但在喷施γ-PGA缓解逆境胁迫的相关研究中，主要是围绕SOD、POD、CAT这3种酶进行分析和研究[15]。因此，本研究也仅分析SOD、POD和CAT活性的变化。第2批供试各处理水培辣椒自顶向下取第2～3片幼嫩叶片，称取0.1 g鲜样分别标记，液氮速冻后于-80 ℃超低温冰箱保存，用于酶活性测定。SOD、POD和CAT酶活性均采用苏州科铭生物试剂盒测定，每个处理重复3次。

1.3.4 叶绿素荧光参数 采用便携式光合系统(LI-6400 XT，美国)配以叶绿素荧光叶室，测定第2批供试水培辣椒成熟叶片最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学效率(ΦPSⅡ)、电子传递速率(ETR)、光化学淬灭(qP)和非光化学淬灭(NPQ)，光照强度设定为300 μmol/(m2·s)，气温25 ℃。

1.3.5 Cd及矿质元素含量 植物样品中的矿质元素及Cd含量参考国家标准方法测定。将Cd10和Cd10+PGA处理辣椒幼苗样品分别标记后,装入牛皮纸袋烘干并粉碎，称取粉碎的植株样品0.5 g于消化管中，加入20 mL混合酸(硝酸与高氯酸体积比为4∶1)，过夜后在消解炉上高温消解，加去离子水定容至50 mL，过滤后用电感耦合等离子体发射光谱仪(iCAP6300，美国)测定植物样品中的Fe、Mn、Zn及Cd含量。

1.4 数据统计与分析

每个指标重复测定3次取平均值。利用Microsoft Excel 2016进行数据图表处理，用SPSS统计分析软件中的Duncan’s进行新复极差法多重比较。

2 结果与分析

2.1 γ-PGA 对辣椒幼苗生物量、果实形态及产量的影响

由图1可知，在整个水培期间，施用0.1 g/L γ-PGA的辣椒幼苗整株鲜质量均高于对照，且这种促进效果随着水培时间的延长而增强；尤其是在水培60 d时，施用0.1 g/L γ-PGA的辣椒幼苗鲜质量较对照增加了11.94%。由表1可知，叶片喷施0.1 g/L γ-PGA可以显著提高辣椒的单株结果数、单株产量及收果时长，分别较对照增加了13.48%，15.94%和19.23%；喷施0.1 g/L γ-PGA后单果质量和果实长度虽也有所增加，但与对照差异均不显著。可见施用γ-PGA能促进辣椒的生长，提高果实产量。

图1 γ-PGA对辣椒幼苗鲜质量的影响Fig.1 Effects of γ-PGA on fresh weight of pepper seedlings

表1 γ-PGA对辣椒果实形态及产量的影响Table 1 Effects of γ-PGA on morphology and yield of pepper fruits

2.2 γ-PGA对Cd胁迫辣椒幼苗生长速率的影响

γ-PGA对Cd胁迫辣椒幼苗生长速率的影响结果见图2。

图柱上标不同小写字母表示处理间差异达到5%显著水平，下同Different lowercase letters indicate significant difference at 5% level.The same below图2 γ-PGA对Cd胁迫辣椒幼苗生长速率的影响Fig.2 Effects of γ-PGA on growth rate of pepper seedlings under different Cd stress

图2表明，Cd胁迫显著抑制了辣椒幼苗地上部的伸长生长，且Cd质量浓度越高，辣椒幼苗的生长速率降低越明显。当Cd质量浓度为10 mg/L时，辣椒幼苗的生长速率仅为未添加Cd处理的21.63%(P<0.05)。γ-PGA能够不同程度地促进Cd胁迫辣椒的生长，而且这种促进效果随Cd质量浓度增大而越发明显。当水培液中不添加Cd时，施用γ-PGA后辣椒的生长速率最大，较未添加γ-PGA处理增加了38.46%(P<0.05)；当Cd质量浓度分别为5和10 mg/L时，喷施γ-PGA处理辣椒幼苗的生长速率较未添加γ-PGA处理分别提高56.04%和68.89%。

2.3 γ-PGA对Cd胁迫辣椒幼苗叶绿素含量的影响

图3显示，Cd胁迫可以不同程度地降低辣椒叶片的叶绿素含量，在高质量浓度(10 mg/L )Cd胁迫下，辣椒幼苗的叶绿素a和b含量显著低于无Cd处理。正常生长状态下，叶片喷施0.1 g/L γ-PGA可显著增加辣椒叶片的叶绿素b含量。在较低质量浓度(5 mg/L)Cd胁迫条件下，施用γ-PGA后辣椒叶片的叶绿素含量与未添加γ-PGA处理相比差异不显著，且接近正常水平。而在高质量浓度(10 mg/L) Cd胁迫下，与未添加γ-PGA处理相比，施用γ-PGA后叶绿素a和叶绿素b含量显著提高了35.46%和20.77%，而且能够恢复到正常生长水平。

图3 γ-PGA对Cd胁迫辣椒叶片叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of γ-PGA on chlorophyll contents of pepper seedlings under Cd stress

2.4 γ-PGA对Cd胁迫辣椒幼苗叶绿素荧光特性的影响

由表2可知，随着Cd胁迫的加重，叶绿素荧光参数Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ和ETR均逐渐下降，而NPQ则显著上升,γ-PGA处理对正常生长辣椒的荧光参数无明显影响。低质量浓度Cd(5 mg/L)胁迫下，与未施用γ-PGA相比，γ-PGA处理辣椒叶片ETR显著增加，NPQ显著降低，其他荧光参数无显著变化。10 mg/L Cd胁迫使辣椒叶片的光化学效率受到显著抑制，施用γ-PGA则能使之得到有效缓解，除Fv/Fm无显著变化外，qP、ΦPSⅡ及ETR均显著升高(P<0.05)，分别较未施用γ-PGA处理增加了9.52%，13.89%和13.16%；NPQ则显著降低6.90%(P<0.05)；但总体来看，各荧光参数仍显著低于正常生长幼苗。

表2 γ-PGA对Cd胁迫辣椒叶绿素荧光特性的影响Table 2 Effects of γ-PGA on chlorophyll fluorescence characteristics of pepper seedlings under Cd stress

2.5 γ-PGA对Cd胁迫辣椒抗氧化酶活性的影响

由表3可以看出，Cd胁迫显著降低了辣椒叶片的抗氧化酶活性，且胁迫程度越强酶活性下降越明显，尤其是当Cd质量浓度为10 mg/L时，SOD、POD、CAT活性较未胁迫处理(Cd0)分别降低了22.65%，24.60%和34.45%。

表3 γ-PGA对Cd胁迫辣椒抗氧化酶活性的影响Table 3 Effects of γ-PGA on antioxidant enzyme activities of pepper seedlings under Cd stress

表3显示，施用γ-PGA可以有效缓解Cd的抑制作用。未受Cd胁迫时，施用γ-PGA可以显著增强SOD和POD活性，但CAT活性升高不显著；当Cd质量浓度为5 mg/L时，γ-PGA处理后辣椒叶片的SOD、POD、CAT活性分别较未喷施γ-PGA处理显著升高了17.38%，15.72%和13.29%，SOD活性甚至提高到了正常生长水平；高质量浓度Cd(10 mg/L)胁迫下，仅CAT活性较未添加γ-PGA处理显著提高了23.90%(P<0.05)。说明γ-PGA处理对低水平Cd胁迫下的抗氧化酶活性有明显促进作用，但Cd胁迫程度加重时，这种促进效果有所减弱。

2.6 γ-PGA对Cd胁迫辣椒幼苗Cd及营养元素含量的影响

由表4可知，当Cd质量浓度为10 mg/L时，γ-PGA处理后辣椒植株的Fe、Mn和Zn含量分别显著增加了24.04%，82.95%和45.68%；叶面喷施γ-PGA可以显著抑制辣椒植株对Cd的吸收，施用γ-PGA处理辣椒的Cd含量较未施处理显著降低了19.05%。

表4 γ-PGA对Cd胁迫辣椒养分元素及Cd含量的影响Table 4 Effects of γ-PGA on nutrient elements and Cd contents of pepper seedlings under Cd stress mg/kg

3 讨 论

γ-PGA作为一种新型生物肥料增效剂，可促进植物生长和养分吸收，这已经在菠菜[16]和番茄[7]等蔬菜作物上得到了证实。尽管目前对γ-PGA促进植物生长的机制还不清楚，但已有研究发现，该过程主要通过影响植物氮代谢来完成[17]。研究发现，生长季节叶施PGA肥可促进生姜植株生长，提高植株鲜质量以及鲜姜茎块产量[18]；叶面喷施0.1～0.3 mg/L γ-PGA可有效提高温州蜜柑的产量和品质[19]。本研究表明，叶面施用0.1 g/L γ-PGA不仅增加了水培辣椒幼苗的鲜质量，而且明显提高了盆栽辣椒果实数量和产量，大大延长了收果时间。因此，γ-PGA对辣椒植株生长及产量有明显的促进作用，这与上述研究结果[18-19]一致。

叶绿素参与了植物光合作用中光能的吸收、传递和转换，对植物生长起重要作用。Cd进入植物体后能够抑制叶绿素合成相关酶的活性或直接破坏叶绿体结构，致使叶绿素合成降速或分解加快，进而抑制植物的光合作用[20]。本试验中，在Cd胁迫下辣椒幼苗地上部生长速率明显受到抑制，叶片叶绿素含量下降，尤其是在10 mg/L Cd胁迫下，辣椒幼苗地上部生长速率下降了近80%，叶绿素含量降低了约25%；施用γ-PGA后，叶绿素含量升高，生长速率显著增加，说明γ-PGA能够有效缓解Cd胁迫对辣椒叶片叶绿素合成的抑制作用。可能是γ-PGA具有生物可降解性，极易分解形成谷氨酸，可作为氮源供植物直接吸收利用，而氮素是叶绿素的主要成分，能够促进叶绿素的合成以及光能的捕获，进而促进植物的生长[21]。

Cd对植物光合系统具有破坏作用，尤其是光系统Ⅱ(PSⅡ)较光系统Ⅰ(PSⅠ)更易受到Cd的毒害[22]。叶绿素荧光反映了光合作用过程中PSⅡ对光能的吸收、传递、耗散和分配情况，可了解Cd胁迫对植物PSⅡ光化学活性的影响[23]。本研究表明，在5 和10 mg/L Cd胁迫下，辣椒幼苗Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ和ETR均有不同程度降低，而NPQ显著升高，这与赖秋羽等[24]在番茄上的研究结果相似，即Cd胁迫会导致辣椒叶片PSⅡ活性中心遭到破坏，电子传递受阻，热耗散增加，且胁迫越严重抑制效果越明显。本研究中，经0.1 g/L γ-PGA处理后，辣椒幼苗叶片Fv/Fm、qP、ΦPSⅡ和ETR较单一Cd胁迫处理均有不同程度升高，同时伴随着NPQ的降低，说明γ-PGA对Cd胁迫辣椒叶片PSⅡ反应中心具有一定的保护作用，能够缓解Cd对PSⅡ原初光化学活性的抑制作用，提高光合电子传递速率，降低热耗散，使得PSⅡ天线色素吸收的光能更多更有效地用于光化学反应，维持了PSⅡ的正常功能，进而提高了Cd胁迫辣椒植株的生长速率[25]。

逆境胁迫通常会导致植物体内活性氧包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢的明显增加，而较高浓度的活性氧会损伤细胞膜系统，造成氧化胁迫，进而阻碍植物生长甚至导致死亡[26]。SOD、POD和CAT是植物体内ROS清除系统的重要保护酶，在其协同作用下能够有效清除植物体内的活性氧自由基。研究表明，Cd胁迫会导致Cd2+直接取代这些酶活性中心的金属元素或与酶的半胱氨酸残基结合，从而抑制酶活性[4,27]。本研究表明，Cd胁迫条件下,辣椒幼苗SOD、POD和CAT活性随Cd质量浓度的提高而显著下降。而张菊平等[28]的研究结果却表明，辣椒抗氧化酶活性随着Cd质量浓度的增加先升高后降低。这可能是辣椒品种不同所致。叶面施用γ-PGA后，不同质量浓度Cd胁迫处理辣椒的SOD、POD和CAT活性均有不同程度升高，尤其是在Cd质量浓度为5 mg/L时，抗氧化酶活性升高最为显著。表明外源γ-PGA可以增强Cd胁迫辣椒幼苗SOD、POD和CAT的活性水平，使幼苗能更及时地清除活性氧自由基，减轻细胞的氧化胁迫，维持细胞膜的结构和功能。

作为植物生长的非必需元素，当Cd2+进入植物体内后，可取代金属离子，如Zn2+、Mg2+和Fe2+等在金属蛋白中的结合位点，干扰植物的离子平衡[29]。γ-PGA为一种高分子聚合物，其分子侧链含有大量的羧基，电离产生的阴离子附着在高分子链上，对Ca、Mg、Cu、Zn等阳离子状态的矿质养分具有较强的吸附和活化作用，有助于提高养分有效性[30-31]。本研究表明，在10 mg/L Cd胁迫下，叶面施用γ-PGA能显著增加辣椒幼苗体内的Fe、Mn、Zn含量，这与黄巧义等[21]在菜心上的研究结果相似。Pang等[10]发现，施用不同浓度γ-PGA能抑制黄瓜对重金属Cd和Pb的吸收。本研究中，叶面喷施γ-PGA后，辣椒植株Cd含量显著降低，可能是Cd在植物体内的吸收转运并无专用的运输蛋白，而是与Ca、Mg、Fe等其他阳离子状态的金属离子竞争同一阳离子通道[32]，施用γ-PGA提高了辣椒植株体内Fe、Mn、Zn等有益矿质元素含量，因而对Cd形成竞争作用，从而抑制辣椒对Cd的吸收。

4 结 论

γ-PGA可促进辣椒幼苗生长，提高植株鲜质量和单株收果数及果实产量，延长收果时间。不同程度Cd胁迫导致辣椒幼苗代谢紊乱，生长受到严重抑制，叶面施用γ-PGA可提高Cd胁迫辣椒幼苗叶绿素含量及光能利用率，以及抗氧化酶活性和 Fe、Mn、Zn等有益矿质元素含量，减少辣椒对有害元素Cd的吸收，从而有效缓解Cd胁迫对辣椒幼苗造成的伤害，促进辣椒幼苗生长，而且胁迫程度越严重，这种缓解效应越显著。