符晓莹，朱雄，麦珍，王立程，王崇圳，韩丽梅，李欢，陈海

三亚市人民医院检验科/中心实验室， 海南 三亚 572000

栖稻假单胞菌(Pseudomonasoryzihabitans，P.oryzihabitans)是一类非发酵的需氧革兰氏阴性杆菌，该菌广泛存在于自然界，在稻叶上定植，通常存在于水、泥土和潮湿环境中，包括医院环境中的下水道、呼吸机、含水的医疗器械和洗手盆等[1-2]。1977年，Pien[3]从1例硬膜外脑出血患者的血培养中分离发现该菌，这是栖稻假单胞菌作为致病菌首次被临床报道。目前，栖稻假单胞菌作为条件致病菌和院内感染菌，多分离自免疫功能低下、肝脏损伤、肿瘤或慢性肾脏疾病患者[4]，在软组织感染、肺炎、心内膜炎和菌血症等[1-2, 5-6]中常见，偶见于特殊病例如假体周围关节感染[7]等。目前，国内外对栖稻假单胞菌感染的临床病例报道相对较少，导致临床医务人员对该菌的认识不足。本文对就诊于三亚市人民医院重症监护治疗病房(intensive care unit，ICU)的1例患者血培养中分离并鉴定出的1株栖稻假单胞菌报道如下。

1 临床资料

1.1 病例

患者男性，33岁，黎族，公司职员，家住海南省陵水黎族自治县。该患者于2019年11月17日就诊于陵水县人民医院，就诊前半月余无明显诱因出现双下肢水肿，未予注意；就诊前3 d出现全身乏力、气短、尿少，伴恶心、呕吐等症状，仍未予注意。就诊当天以上症状进一步加重。生化检查：肌酐234.0 μmol/L，血钾6.89 mmol/L；胸部、腹部CT：左肺上叶炎症、心包少量积液、右侧胸腔积液、左侧胸膜增厚、脂肪肝、肝脏形态增大、腹腔积液、双侧肾周渗出改变。县医院考虑患者病情极为危重，于就诊当日便将其转入三亚市人民医院抢救，急诊科以“肾功能衰竭、高钾血症”收入ICU。

入院查体：体温35.8 ℃，脉搏94次/分，血压107/83 mmHg(多巴胺维持下)。双下肢中度水肿，双小腿见散在色素沉着。血常规检查：白细胞17.23×109/L，中性粒细胞比率 81.9%，血红蛋白 137 g/L，血小板200×109/L；生化检查：肌酐281 μmol/L，降钙素原3.98 ng/mL，谷丙转氨酶996 U/L，血钾7.06 mmol/L；心肌钙蛋白I 1.33 μg/L。患者既往体健，否认高血压、冠心病、糖尿病等病史。

入院诊断：急性肾损伤；肺部感染；脓毒性休克；脂肪肝；肝功能不全；多器官功能障碍综合征。

治疗：入院后告病危，给予静脉滴注亚胺培南西司他丁(泰能)1.0 g，每8 h 1次，联合莫西沙星 0.4 g，每日1次，加强抗感染；并加强炎症因子清除、补液抗休克以及纠酸对症支持治疗，但预后极差。患者入院立即送检做血培养，24 h后报告阳性，涂片染色镜检可见革兰阴性杆菌。回报血培养危急值时，临床告知患者已出院。出院原因系患者家属因自身因素主动要求。出院时患者呈昏迷状，血压 83/45 mmHg(去甲肾上腺素3.0 μg·kg-1·min-1、肾上腺素3.0 μg·kg-1·min-1维持下)，血氧饱和度96%。双侧瞳孔等大等圆2.0 mm，对光反射稍迟钝。

1.2 材料与方法

1.2.1 主要试剂哥伦比亚血琼脂平板、嗜血巧克力琼脂平板、中国蓝琼脂平板和水解酪蛋白琼脂(Mueller-Hinton, MH)培养基购于广州迪景微生物科技有限公司；血液增菌培养瓶购于美国 BD 医疗器械公司；质谱专用基质(一般细菌)购于生物梅里埃公司；药敏试验纸片购于Oxoid Limited公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购于北京天根生化科技公司；PCR Master Mix和2000 Marker购于上海翊圣科技有限公司。质控标准菌株大肠埃希菌 ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 15442由国家卫生健康委员会临床检验中心提供。

1.2.2 主要仪器全自动血培养仪(BDBACET/FX/200)购自美国 BD 医疗器械公司，迪尔细菌鉴定系统 (DL-96Ⅱ)购自珠海迪尔生物工程有限公司，全自动快速微生物质谱检测系统(VITEK MS IVD V3.2)购自生物梅里埃公司，PE基因扩增仪(PE-9700)购自美国应用生物系统公司，高电压电泳仪(PowerPac HV)购自美国Bio-Rad公司，紫外线透射分析仪(UV-3C)购自珠海黑马医学仪器有限公司。

1.2.3 细菌分离培养按照《临床微生物检验标准化操作程序》《实用临床微生物学检验与图谱》等权威著作和执行标准提供的方法[8-9]进行。采集后的血培养标本立即置于全自动血培养仪中35 ℃孵育，24 h后需氧瓶报阳性，立即取出置于生物安全柜内进行分离培养。用无菌注射器抽取需氧瓶中血液标本适量，分别接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和中国蓝琼脂平板，同时进行涂片及革兰染色镜检。

1.2.4 质谱仪鉴定依据制造商说明书和《中国临床微生物质谱应用专家共识》[10]进行质谱操作和结果判读。分离菌在血琼脂平板生长24 h后，用一次性无菌接种环挑取单个适量菌落，均匀涂布于靶板，用1 μL基质液封板，置室温干燥后使用VITEK MS IVD V3.2对分离菌进行鉴定。以大肠埃希菌 ATCC 25922进行质控。

1.2.5 生化试验分离菌在血琼脂平板生长24 h后，挑取单个菌落溶于无菌生理盐水，配置成0.5麦氏浓度的菌悬液，选择迪尔96NE鉴定板，经迪尔细菌鉴定系统 DL-96Ⅱ进行生化试验。

1.2.6 药物敏感试验(antimicrobial susceptibility test，AST)参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI )M100抗菌药物敏感性试验执行标准(2019版)[11]中铜绿假单胞菌药敏试验标准，采用纸片扩散法进行。取0.5麦氏浓度的菌悬液均匀涂布于MH平板，每个平板贴的药敏纸片不超过5个，并将平板置于35 ℃普通培养箱中，24 h后测量抑菌环的直径进行结果判读。以铜绿假单胞菌ATCC 15442进行质控。

1.2.7 16S rRNA测序分析分离菌TS383在血琼脂平板生长48 h后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA；实验所用16S rRNA通用引物为27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGC-TCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACG-ACTT-3′)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)体系为：25 μL PCR Master Mix，上、下游引物和模板DNA各2 μL，加无核酸水补足至50 μL；反应条件为：94 ℃，30 s；52℃，30 s；72 ℃，90 s，30个循环。扩增产物送北京睿博兴科公司研发部进行TA克隆测序。

1.2.8 系统发育树构建根据16S rRNA测序结果，运用在线Blast软件进行序列比对，选择同源性较高的假单胞菌属部分模式菌株，以醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus，A.calcoaceticus)ATCC 23055作为外群菌株，运用Mega 7.0软件构建系统发育树。所有菌株16S rRNA序列均从美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) GenBank获取。

2 结果

2.1 细菌培养特征及生化特征

分离株TS383经35 ℃ 24 h培养，在血琼脂平板上可见圆形、皱纹菌落，直径1～2 mm(见图1A)；在中国蓝琼脂平板上为光滑菌落，微凸起，边缘整齐(见图1B)；在巧克力琼脂平板上可见明显的异质性菌落特征(见图1C)；固体培养基上的菌落都具有典型黄色色素。进行涂片染色镜检，显示为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，大多散在或成对排列。该菌氧化酶试验阴性，触酶试验阳性，其他生化特征如表1所示。

A: Cultured on blood agar. B: China blue agar. C: Chocolate agar.

表1 分离株TS383的生化特征(DL-96Ⅱ鉴定)

2.2 质谱检测系统鉴定

经质谱仪VITEK MS IVD V3.2鉴定，分离株TS383为栖稻假单胞菌，置信度为99.9%。

2.3 药物敏感试验

分离株TS383对头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南均敏感，对氨曲南、氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛耐药。

2.4 16S rRNA测序结果

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测为约1.5 kb的单一条带(见图2)，与目的条带相符。经北京睿博兴科公司研发部进行TA克隆测序，将序列递交GenBank，获得序列号MN911431.1，并运用在线Blast软件进行序列比对。经比对，分离株TS383与GenBank中耐冷假单胞菌(Pseudomonaspsychrotolerans，P.psychrotolerans)C36T和P.oryzihabitansNBRC 102199T(LMG 7040T)的同源性最高，分别是99.79%和99.73%。

图2 分离株TS383的16S rRNA扩增产物电泳图

2.5 系统发育树分析

系统发育树如图3所示。目前假单胞菌属中的有效命名成员多达212个，因此只选择16S rRNA基因序列同源性较高的部分假单胞菌构建系统发育树。模式菌株序列从GenBank获取，选择A.calcoaceticusATCC 23055作为外群。使用软件Mega 7.0比对序列，手工编辑去除不明确的核苷酸和缺口，并采用最大似然法(maximun likelihood)建树。系统发育树显示，分离株TS383与P.psychrotoleransC36T以及P.oryzihabitansNBRC 102199T(LMG 7040T)进化距离最近，自展值为99%，结果可靠；且P.psychrotoleransC36T与已鉴定的5株栖稻假单胞菌归为同一个集群，距离P.oryzihabitansNBRC 102199T(LMG 7040T)分支长度为0，距离P.oryzihabitansIAM 1568T分支长度<0.001，可见亲缘关系十分相近。

Maximum likelihood was used to build the tree based on 16S rRNA sequence analysis. The number in the node is the reliability of the bootstrap test for 1 000 times.

3 讨论

3.1 命名与鉴定

由于分类学上存在争议，栖稻假单胞菌命名经过多次修改。1985年，因该菌形态学上类似于假单胞菌并可从稻谷中大量分离得到，Kodama等[12]提出命名为栖稻假单胞菌。1987年, Holmes等[13]基于该菌与假单胞菌DNA杂交的同源性较低，提议新属名黄色单胞菌属，即栖稻黄色单胞菌(Flavimonasoryzihabitans，F.oryzihabitans)。1997年，Anzai等[14]通过16S rRNA系统进化分析方法，发现假单胞菌属、黄色单胞菌属和金色单胞菌属同源性>93.9%，提议三者列为同一属，并入假单胞菌属。原核生物有效命名表(List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature，LPSN)[15]上注释该菌的正确命名为P.oryzihabitans，F.oryzihabitans为同模异名(homotypic synonym)。

栖稻假单胞菌与假单胞菌属中大部分菌种差异最为显著的一点是，其氧化酶试验阴性，这值得微生物检验人员注意。将本报告分离的TS383株与P.oryzihabitansHainan[16]和P.oryzihabitansNBRC 102199T的生化特征进行对比，部分酶类如鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、尿素酶，部分糖类如麦芽糖、蔗糖等项目，生化反应结果都不尽相同，有时传统的细菌鉴定仪无法准确鉴定。国外有研究者认为，栖稻假单胞菌属于罕见致病菌，各分离株之间的表型特征差异难以鉴定到种的水平，建议采用16S rRNA测序等分子鉴定技术[5,17]。

3.2 与耐冷假单胞菌(P. psychrotolerans)的亲缘关系

耐冷假单胞菌是需氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，菌落呈黄色，氧化酶试验阴性、触酶试验阳性，生长温度4～37 ℃，由Hauser等[18]在2004年发表有效命名。Tran等[19]在2017年对373个假单胞菌属细菌的全基因组DNA-DNA杂交进行计算机模拟，将有效模式种的基因组两两比对后发现，P.psychrotoleransDSM 15758T(DSM 15758T=C36T)和P.oryzihabitansNBRC 102199T存在于同一个基因群(genospecies)中，2个菌株全基因组平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)高达98.5%，意味着这两种菌亲缘关系密切。鉴于P.oryzihabitans发表时间早于P.psychrotolerans，本文提出P.psychrotolerans作为P.oryzihabitans的次定同物异名(junior synonym)。以上结果与本例分离株的系统发育树中所揭示的P.psychrotoleransC36T与P.oryzihabitansNBRC 102199T(LMG 7040T)的亲缘关系结果一致。本例分离株构建的系统发育树仅基于16S rRNA序列，难免有局限性。而ANI分析基于所有直系同源蛋白编码基因比较，克服了DNA-DNA杂交的繁复性和16S rRNA序列分析的保守性，成为目前原核生物分类的金标准[20]，以ANI值的95%～96%作为分类阈值，被广泛应用于细菌种属的重新分类以及未知菌的鉴定。

3.3 耐药性

本例分离株TS383的AST结果显示对大部分抗菌药敏感，包括头孢他啶、头孢吡肟、庆大霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、亚胺培南、美罗培南；而对氨曲南、氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛耐药。这与大多数文献报道的结果相似。需要注意的是，国内发现对3代头孢菌素耐药的栖稻假单胞菌分离株，其中头孢曲松和头孢他啶耐药率分别达50%和37.5%[2, 6]，因此治疗期间应根据AST结果及时调整用药方案。有报道指出，栖稻假单胞菌并非人体正常菌群[5]，根据本例患者的个人信息、入院时的感染指征、血培养分离得到纯菌落以及AST结果，推断该患者社区感染栖稻假单胞菌的可能性大。目前，栖稻假单胞菌感染的病例报道中甚少出现多器官功能衰竭患者，本例患者临床给予泰能联合莫西沙星治疗，但预后极差，可见感染早期使用抗菌药物的必要性。本报道结果提示，微生物检验人员应关注栖稻假单胞菌的案例报道和相关研究，以获取更多资料为临床诊治提供依据。