何燕超，张静，冯净净，揭志军

1. 复旦大学附属上海市第五人民医院呼吸内科，上海 200240； 2. 复旦大学社区健康研究中心(筹)，上海 200240

甲型H1N1流感病毒(简称H1N1)是最常见的呼吸道病毒，呈季节性流行，部分H1N1感染可进展为重症，出现病毒性肺炎，进展速度快，早期即可出现呼吸衰竭，病死率高。目前研究发现，H1N1重症感染可能与过度的炎症反应相关，但具体作用机制仍不明确[1]。

缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α是一种异源二聚体，由α和β 2个亚基组成。HIF-1α主要存在于细胞质内，而HIF-1β存在于细胞核内。生理状态下HIF-1α会被脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylases，PHDs)识别并迅速泛素化进而降解。缺氧状态下PHDs活性受抑制，导致HIF-1α水平升高，HIF-1α可转移到核内与HIF-1β结合形成活性HIF-1，继而作用于DNA激活一系列反应[2]。目前，HIF-1α已被证明可以参与血管生成、内皮细胞分化及纤维化，其与肿瘤的发病及自身免疫性疾病的活动密切相关。而HIF-1α在呼吸道病毒感染中的相关研究较少，尚不明确其作用[3-4]。近年来，一些动物研究发现，机体感染H1N1后，即使在不缺氧的炎症状态下亦可诱导肺HIF-1α水平升高，因此推测HIF-1α可能参与了H1N1感染的炎症反应[5-6]。鉴于此，本研究检测肺巨噬细胞感染H1N1后HIF-1α、干扰素(interferon，IFN)-γ、白细胞介素(interleukin，IL)-6、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和M蛋白(M protein，MBP)的变化，并将HIF-1α活性抑制后，检测IL-6、TNF-α相关通路核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)等蛋白的表达变化，探讨HIF-1α在H1N1感染诱导的炎症反应中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和病毒小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)、犬肾细胞系(MDCK)、流感病毒A/PR/8(H1N1)病毒株来源于美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.1.2 试剂实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)试剂盒、Trizol、RNA溶解液购自北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜、标准蛋白质溶液(BSA)、噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自上海碧云天生物技术有限公司；HIF-1α抗体、NF-κB抗体、MAPK抗体、Akt抗体、MBP抗体、β-actin抗体购自美国Affinity公司；羊抗鼠-HRP购自中国索莱宝公司；蛋白marker购自美国Thermo Scientific 公司；2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-MeOE2)购自美国Selleck Chemicals公司。

1.1.3 主要仪器生物倒置显微镜购自日本Olympus公司；台式低速离心机购自上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂；离心机、荧光定量PCR仪购自德国Eppendorf公司；低温(4 ℃)离心机、酶标仪购自德国Thermo公司；电泳仪购自中国君意公司。

1.2 方法

1.2.1 H1N1 PR8病毒悬液的制备此操作在生物安全二级(biosafety level 2，BSL-2)实验室完成，复苏MDCK细胞，加入细胞培养基(90% MEM细胞培养液+10%小牛血清)，在37 ℃、5% CO2培养箱中传代培养2代，将H1N1 PR8病毒原液稀释后用T25细胞瓶接种于MDCK细胞，用40×物镜每日观察细胞的生长状态。当75%～100%细胞出现病变时，反复冻融2次，用10 mL 无菌移液管吸取病毒液置于15 mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病毒液用半数组织培养物感染量(50% tissue culture infectious dose，TCID50)法测定病毒悬液的毒力：将病毒液作连续10倍稀释，计算各组出现阳性孔率。lgTCID50=L-D(S-0.5)，L：最高浓度稀释度的对数，D：稀释对数之间的差，S：阳性孔比率总和。将病毒液冻于 -80 ℃冰箱待后续实验使用。

1.2.2 H1N1PR8感染细胞复苏RAW264.7细胞，加入细胞培养基(90% MEM细胞生长液+10%小牛血清)，在37 ℃、5% CO2培养箱中传代培养2代后接种于12孔板，设3个复孔，用H1N1PR8感染细胞，调整感染复数(multiplicity of infection, MOI；MOI是指病毒感染单位数与细胞数的比值)为1，分别在0、6、12、24、48 h后收集细胞，提取总蛋白及RNA待检测。以感染灭活H1N1PR8的RAW264.7细胞为对照组。

1.2.3 H1N1PR8感染抑制试验复苏RAW264.7细胞传代培养(方法同感染实验)2代后接种于12孔板，设3个复孔，应用H1N1PR8(MOI=1)感染细胞，同时加入HIF-1α抑制剂 2-MeOE-2 (10 nmol/L)，培养细胞24 h，对照组加入蛋白酶体抑制剂对照品。

1.2.4 PCR检测细胞因子mRNA水平收集细胞加入1 mL Trizol、200 μL氯仿振荡裂解细胞提取RNA，用异丙醇沉淀、乙醇清洗，再加入适量RNA溶解液溶解沉淀物，运用两步法实时PCR进行反转录RNA并扩增(95 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s+55 ℃ 20 s 40个循环、72 ℃ 20 s；95 ℃ 15 s+60 ℃ 15 s；20 min升温 95 ℃ 15 s)，具体引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.5 蛋白质印迹法(Western blot, WB)检测关键蛋白将蛋白裂解液加入经胰酶消化的各组细胞以提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。每孔上样100 μg细胞总蛋白，经分离胶凝胶电泳分离后转移至PVDF膜(条件：4 ℃，100 V/100 mA)，用含3% 标准蛋白质溶液(BSA)的封闭液浸泡PVDF膜，置室温摇床封闭2 h。分别加入HIF-1a抗体、β-actin抗体、NF-κB抗体、MAPK抗体、AKT抗体、MBP抗体4 ℃孵育过夜，洗去多余抗体；加入羊抗鼠-HRP置室温孵育2 h，洗去多余抗体(同前)；经底物化学发光反应后用X线胶片压片，依次放入显影液显影。

1.2.6 细胞存活和生长实验(MTT比色法)用10%胎牛血清悬浮细胞，将细胞接种到96孔板，104个/孔，设3个复孔，给予H1N1 PR8(MOI=1)感染细胞(抑制试验需加入2-MeOE-2)；在培养0、6、12、24、48 h后每孔加入MTT溶液(储存浓度5 mg/mL)20 μL，继续在37 ℃，CO2培养箱中孵育4 h，吸除上清液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min使结晶物充分融解；选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 H1N1感染巨噬细胞后的表型变化

H1N1 PR8感染小鼠巨噬细胞RAW264.7后，在显微镜下观察可见其在感染后6 h即出现细胞聚集现象，感染后24 h见坏死细胞增多，细胞量减少，感染后48 h见坏死细胞明显增多，细胞量明显减少。H1N1 PR8-MBP mRNA水平变化基本与细胞病变表现一致，其在感染后24 h达到高峰，到48 h 开始下降。MTT细胞生长实验结果显示，感染后12 h小鼠巨噬细胞RAW264.7吸光值较于正常对照开始显著下降。具体结果如图1、图2所示。

A: 0 h post infection. B: 6 h post infection. C: 12 h post infection. D: 24 h post infection. E: 48 h post infection. F: Virus titer of PR8 infect RAW264.7. Note: compared with 0 HPI, *P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001; HPI: hour post infection.

A: Compared with un-infected group. B: Compared with 0 HPI.

2.2 H1N1感染巨噬细胞后HIF-1α及炎症因子mRNA水平增高

通过PCR检测H1N1 PR8感染小鼠巨噬细胞RAW264.7后HIF-1α及其他细胞因子mRNA表达水平的变化，发现HIF-1α在感染后6 h开始升高，感染后12 h迅速上升，24 h达到峰值。IFN-γ、IL-6、TNF-α变化趋势基本与HIF-1α一致，在感染6 h开始升高，感染24 h达到高峰，但在感染12 h并未进入快速上升期。具体结果如图2所示。

2.3 H1N1感染巨噬细胞后HIF-1α蛋白及NF-κB通路蛋白表达增高

通过WB进一步检测了H1N1 PR8感染小鼠巨噬细胞RAW264.7后HIF-1α及炎症相关信号通路蛋白表达变化，结果发现HIF-1α蛋白在感染后6 h明显增多，24 h达到峰值，与mRNA水平变化基本一致。NF-κB通路蛋白在感染后12 h明显增多，48 h开始减少，而MAPK、AKT等通路蛋白并未见显著变化。另外，检测RAW264.7细胞内H1N1PR8的MBP水平，结果发现其在12 h开始增多，24 h达到峰值，结果与其mRNA变化基本一致。结果如图3所示。

Note: NF-κB, nuclear factor-κB; MBP, PR8 M protein; MAPK, mitogenactivated protein kinase; HIF-1a, hypoxia inducible factor-1a; AKT, phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B; ACTB, β-actin.

2.4 HIF-1α蛋白与参与炎症反应

在给予小鼠巨噬细胞感染H1N1的同时，加入2-MeOE-2(10 nmol/L)/蛋白酶体抑制剂对照品，培养细胞24 h，在显微镜下观察可见加入抑制剂组(简称实验组)细胞数量较加入蛋白酶体抑制剂对照品组(简称对照组)多，坏死细胞亦较对照组少，MTT细胞生长实验亦显示实验组吸光度值高于对照组。同时，通过PCR检测炎症因子mRNA的水平，发现实验组IL-6、TNF-α等炎症因子的mRNA水平较对照组显著下降(P<0.05)。另外，IFN-γ及MBP mRNA的水平亦有下降(P<0.05)。结果如图4所示。

A: Co-culture with placebo 24 h post infection. B: Co-culture with 2-MeOE-2 24 h post infection. C: The changes of HIF-1α、IFN-γ、IL-6、TNF-α and M-protein mRNA level when co-culture with 2-MeOE-2. D: The change of cell growth when co-culture with 2-MeOE-2.

2.5 HIF-1α可通过NF-κB通路促进炎症反应

重复上述试验，进一步通过WB检测发现实验组NF-κB通路蛋白表达下降，而MAPK、AKT等通路蛋白无变化，同时发现H1N1PR8的MBP亦表达减少。另外， 2-MeOE-2可在细胞感染后 24 h 显著抑制HIF-1α蛋白表达。结果如图5所示。

Note: NF-κB, nuclear factor-κB; MBP, PR8 M protein; MAPK, mitogenactivated protein kinase; HIF-1α, hypoxia inducible factor-1α; AKT, protein kinase B; ACTB, β-actin; 24 h: co-culture with placebo 24 h post infection; 24 h+2-MeOE-2: co-culture with 2-MeOE-2 24 h post infection.

3 讨论

全球每年有300万～500万严重流感病例。据美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)调查，2019—2020年流感季中有 1 900 万人感染流感病毒，至少有1万人死亡[7]。流感病情严重程度与其诱导的过度炎症反应密切相关，但其具体机制尚不明确。因此，本研究从 HIF-1α 参与H1N1诱导炎症反应机制的角度出发，探索其炎症反应机制。已有研究论证巨噬细胞一方面可以吞噬并识别流感病毒，从而分泌 IL-6/TNF-α等炎症因子诱导炎症反应；另一方面，它也可以直接分泌IFN-γ等，具有直接抗病毒的作用[8-9]。因此，本研究建立流感病毒感染巨噬细胞模型，探索HIF-1α在其中诱导炎症反应的机制。

本研究发现，巨噬细胞感染流感病毒后6 h出现聚集现象，12 h出现细胞坏死现象，48 h可见大量细胞坏死。由MTT细胞生长曲线结果可知，巨噬细胞感染H1N1PR8后12 h生长受抑制，48 h明显受抑制。进一步研究发现，病毒复制率在24 h达到高峰，IFN-γ、IL-6、TNF-α mRNA表达水平与病毒复制率基本一致。这些结果说明巨噬细胞可分泌IFN-γ抗病毒，同时可分泌IL-6、TNF-α 参与炎症反应。其他一些动物研究结果与本研究结果一致。Halstead等[9]研究发现小鼠感染H1N1PR8后可促进M1型巨噬细胞分化，促进炎症反应，同时亦可诱导巨噬细胞分泌IFN-γ；Xu和Liu[10]进一步研究发现，巨噬细胞感染H1N1PR8后可通过NF-κB通路诱导炎症反应。本研究中HIF-1α mRNA水平相对IL-6、TNF-α等炎症因子更早升高，说明 HIF-1α 可能更早参与流感病毒诱导的炎症反应。在蛋白水平检测HIF-1α，发现其在6 h即开始显著上升，24 h达到最高峰。HIF-1α、IFN-γ、IL-6、TNF-α 等在48 h表达下降，可能与流感病毒感染巨噬细胞导致坏死相关。之前筛查细胞感染病毒后NF-κB、APK、AKT等炎症相关通路蛋白[11-13]表达在上述时间点变化，发现NF-κB通路蛋白在感染12 h开始增高。这可能说明，NF-κB通路是HIF-1α的通路蛋白，此结果与Xu和Liu[10]的研究结果一致。目前，关于HIF-1在流感领域的研究较少。Guo等[14]给予肺上皮细胞A549、单核细胞THP-1不同滴度的H1N1PR8感染，24 h后收样，并未发现HIF-1α mRNA在感染后有变化，进一步研究发现A549、THP-1细胞感染流感病毒后，HIF-1α转入细胞核内量增多，这与本研究得到的结果有相似之处。

因各类蛋白在24 h变化最明显，本研究选择在感染24 h加入HIF-1α抑制剂2-MeOE-2，发现加入2-MeOE-2后坏死细胞数较单纯感染组明显减少；在mRNA水平，IL-6、TNF-α、IFN-γ、MBP等均有明显下降；在蛋白水平，NF-κB、MBP表达均有下降。结果表明，HIF-1α通过NF-κB通路上调IL-6、TNF-α等参与H1N1诱导的炎症反应。MBP蛋白受抑制可能为炎症反应受抑制的间接表现，不能说明HIF-1α有直接抗病毒作用。本研究得到的结论仍有其局限性，须通过更进一步的动物试验及临床检测结果来验证。

综上所述，H1N1感染后巨噬细胞中的HIF-1α可直接诱导炎症反应的产生，其途径可能是通过激活NF-κB通路促进IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌参与炎症反应。在本研究的细胞试验中，HIF-1α展现出良好的前景，可能为流感治疗提供一个新视点。