严晓春 李玥 何飞燕 胡晓华

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，其发病率及病死率较高，已成为世界范围内女性生殖系统恶性肿瘤死亡的主要原因[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作为一种内源性、非编码小分子RNA，参与细胞的增殖、分化、凋亡和新陈代谢等过程，在恶性肿瘤的发生发展中起到重要作用[2，3]。近年来研究发现，miR-205及miR-944在子宫内膜癌中异常表达，参与子宫内膜癌的发生发展，并有望作为子宫内膜癌早期诊断及预后评估的生物学指标[4，5]。但miR-205及miR-944能否作为诊断宫颈癌的新型生物学标志物，目前尚未明确。本研究通过分析宫颈癌患者血清miR-205及miR-944的表达水平与临床病理指标的关系，探讨miR-205及miR-944对宫颈癌的诊断价值，旨在为宫颈癌的诊断及靶向治疗提供参考依据。

资料与方法

1 研究对象 选取2017年1月～2019年12月上海交通大学医学院附属第九人民医院收治的宫颈癌患者162例（宫颈癌组），年龄32～74（47.35±9.62）岁。纳入标准：①符合国际妇产科联合会（FIGO）分类标准[6]，且经病理确诊为宫颈癌者；②术前均未接受放射治疗、化疗或生物免疫治疗者；③能配合本次研究及病历资料完整者。排除标准：①随访过程中失访，病例资料不完整者；②术前已行放疗、化疗或生物免疫治疗者；③术前有急慢性感染性疾病、血液系统疾病、自身免疫性疾病及合并其他恶性肿瘤者。162例宫颈癌患者的临床分期：I期87例，Ⅱa期50例，Ⅱb期25例；病理类型：鳞状细胞癌142例，腺癌20例；有淋巴结转移34例，无淋巴结转移128例。另取同期CIN患者85例作为CIN组和健康体检女性65例作为对照组。三组间年龄、体质指数等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），组间具有可比性。本研究获得医院伦理委员会批准，并与患者或家属签署知情同意书。

2 引物设计与合成 miR-205引物，上游：5'-AGAACTTATACTGAGTGAGG-3'，下游：5'-GAAGTCAAGATCGAATTG-3'；miR-944引物，上游：5'-GTCCAGCAGATGACTCAATG-3'，下游：5'-ATCCATGAAGCATACGTG-3'。

3 miR-205及miR-944检测 所有研究对象均于清晨抽取空腹静脉血5 mL置于未加抗凝剂的离心管中，于室温2500 r/min离心15 min，吸取上层血清400 μL，加入1 mL提取剂（Trizol），于-70 ℃保存。在ABI 7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上进行实时荧光定量PCR。以U6为内参，miRNA逆转录反应体系15 μL：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μL 100 mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，1 μL逆转录酶（50 U/μL），1.50 μL反转录缓冲液（10×），0.19 μL RNase抑制剂（20 U/μL），4.16 μL无菌三蒸水。反应条件：16℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。扩增反应体系20 μL：1 μL引物及探针Mix（20×），10 μL TaqMan通用混合物溶液（2×），1.33 μL反转录产物cDNA，7.67 μL无核酸酶的水。每个反应体系中荧光信号达到设定阈值所经历的循环数即为Ct值，采用2-△△Ct法计算miR-205及miR-944相对表达水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

4 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件分析，计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；两独立样本均数的比较采用成组t检验。绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）分析血清miR-205及miR-944对宫颈癌的诊断价值，曲线下面积（area under cure，AUC）比较采用Z检验。相关性分析采用Pearson相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 各组血清miR-205及miR-944表达水平比较 宫颈癌组血清miR-205及miR-944表达水平明显高于CIN组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；而且CIN组血清miR-205及miR-944表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2 宫颈癌患者血清miR-205及miR-944表达水平与临床病理特征的关系 宫颈癌患者血清miR-205及miR-944表达水平与临床分期、浸润深度及淋巴结转移有关（P＜0.05），而与年龄、绝经、病理类型、分化程度、肿瘤直径及脉管浸润无关（P＞0.05）。见表2。

表1 各组miR-205及miR-944表达水平比较（±s）

表1 各组miR-205及miR-944表达水平比较（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.01；与CIN组比较，bP＜0.01

组别 n miR-205 miR-944对照组 65 0.14±0.10 0.03±0.01 CIN组 85 0.71±0.13a 0.46±0.02a宫颈癌组 162 1.25±0.61ab 0.82±0.38ab F值 10.148 8.217 P值 ＜0.001 ＜0.001

表2 宫颈癌患者血清miR-205及miR-944表达水平与临床病理特征的关系

3 血清miR-205及miR-944对宫颈癌的诊断价值 血清miR-205及miR-944水平诊断宫颈癌的最佳截断值分别为0.94、0.53。两项联合诊断宫颈癌的AUC为0.926（95%CI：0.864～0.985）明显高于单项miR-205（0.831，95%CI：0.774～0.890）及miR-944（0.802，95%CI：0.741～0.859），差异有统计学意义（Z=5.820，6.205，P＜0.05），其敏感度和特异度为92.0%和88.7%。见表3和图1。

4 各组研究对象血清miR-205与miR-944表达水平的相关性分析 Pearson相关分析显示，宫颈癌患者血清miR-205与miR-944表达水平呈正相关（r=0.824，P＜0.01）。见图2。

表3 血清miR-205及miR-944对宫颈癌的诊断价值

图1 血清miR-205及miR-944诊断宫颈癌的ROC曲线

图2 宫颈癌患者血清miR-205与miR-944表达水平的相关性分析

讨 论

宫颈癌的发生发展是一个极其复杂的多因素、多阶段调节过程，近年来其发病率明显增加，而且呈年轻化趋势，严重威胁女性的生命健康。miRNA是一类长度为21～25 nt的内源性单链非编码RNA分子，可激活多种胞内信号通路，参与调控细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移和分化等过程，影响恶性肿瘤的发生发展，有望成为肿瘤治疗的重要靶点[5，7]。有研究表明，miRNA在宫颈癌中异常表达，与宫颈癌的发生、发展、转移及预后密切相关，可作为宫颈癌早期诊断和预后判断的新型标志物[8，9]。近年来研究证实，miR-205及miR-944可以通过多种信号通路在恶性肿瘤的发生发展、侵袭、转移及耐药等病理过程中发挥重要作用，有可能成为恶性肿瘤诊断、治疗和预后判断的新靶点[10，11]。LIU等[12]研究表明，miR-205参与介导宫颈癌发展过程中的细胞生长、凋亡、迁移和侵袭，miR-205的表达异常在人类宫颈癌的发展中起着重要的促进作用。XIE等[13]研究发现，在宫颈癌组织中，miR-944的含量明显高于正常对照组，这为其在宫颈癌发生中的作用提供新的信息。

本研究显示，宫颈癌组血清miR-205及miR-944表达水平均明显高于CIN组和对照组，而且CIN组血清miR-205及miR-944表达水平明显高于对照组，提示miR-205及miR-944可能发挥癌基因作用促进宫颈癌的发生发展。本研究中Ⅱa+Ⅱb期宫颈癌患者血清miR-205及miR-944表达水平明显高于Ⅰ期患者，浸润深度＞1/2肌层的患者血清miR-205及miR-944表达水平明显高于深度≤1/2肌层的患者，有淋巴结转移的患者血清miR-205及miR-944表达水平明显高于无淋巴结转移者，表明miR-205及miR-944与宫颈癌较差的临床病理特征有关。分析其原因可能是临床病理特征较差的宫颈癌患者病情进展较快，肿瘤负荷较大，肿瘤组织可抑制更多的抑癌基因进入血液，同时可促进机体表达具有癌基因作用的miR-205及miR-944，进而导致miR-205及miR-944水平异常升高。XIE等[14]研究发现，miR-205促进人宫颈癌细胞的增殖和迁移，在宫颈癌的发生及临床诊断中具有潜在价值。PARK等[15]研究表明，宫颈癌组织miR-944表达水平明显高于正常组织，且与淋巴结转移及临床分期相关，miR-944高表达与宫颈癌患者总生存率较低有关，可作为宫颈癌预后评估的潜在生物标志物。

本研究应用ROC曲线分析显示，血清miR-205及miR-944诊断宫颈癌的最佳截断值分别为0.94、0.53，两项联合诊断宫颈癌的曲线下面积最大，其敏感度和特异度较高。相关分析显示，宫颈癌患者血清miR-205与miR-944表达水平呈正相关。这说明miR-205及miR-944可作为诊断宫颈癌的非侵入性生物学标志物，两项联合检测有助于提高对宫颈癌的诊断价值。MA等[16]研究显示，宫颈癌患者血清miR-205水平显著升高，且与淋巴结转移和肿瘤分期增加有关，高表达miR-205的宫颈癌患者总体生存率较低，是预测宫颈癌预后的生物标志物。另有研究表明，分析miRNA表达及其相关靶基因，为了解宫颈癌的发病机制和预后提供了有效的生物学信息，并可作为宫颈癌高危人群早期筛查和早期诊断的生物学标志物[17]。

综上所述，宫颈癌患者血清miR-205与miR-944表达水平明显升高，且与临床分期、浸润深度及淋巴结转移有关，有助于指导宫颈癌的早期诊断，两项联合检测对指导宫颈癌的诊断具有较高价值。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突