范亮峰 陆琼 姜跃琴 王中英 向东

近期爆发的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）疫情逐渐演变为全球公共卫生危机。它具有广泛、快速的传染性，且已造成严重后果。有研究报道该病毒可存在于新冠患者的血液中[1，2]，因此血液检测存在感染的风险。冠状病毒对热敏感[3]，人血液样本56℃孵育30 min被认为是有效灭活新冠病毒的简易方法[4，5]，用于医院输血科、血站检验科等实验室，对实验人员的安全有一定防护作用，然而该处理严重偏离了实验血样的常规保存条件，且无同类数据可供参考。本文通过对血液样本56 ℃孵育处理后，红细胞溶血、表面抗原及血清抗体变化的研究，探讨孵育过程对红细胞ABO、RhD抗原及抗体的影响。

对象与方法

1 对象 从上海地区随机抽取正常献血者A型20例，B型20例，AB型10例，O型20例，均为RHD阳性；ABO亚型7例，D变异型6例（包含弱D型和部分D型，以下均简称Dv型）。以上均为新鲜抗凝全血。

2 仪器与试剂 ABO/Rh血型正定型卡、抗-IgG抗球蛋白反应卡（奥森多医疗器械有限公司，批号分别为：ABR132F、IGC062F），单克隆抗-A、抗-B、IgM抗-D、IgG抗-D血型定型试剂、ABO反定型红细胞、血型分析用稀释液（上海血液生物医药，批号分别为：20190203、20190203、20181810、20180626、20205304、20196201），Ortho半自动血型分析仪（Ortho 工作站系统，奥森多医疗器械有限公司），Ortho全自动血型分析仪（OrthoVISION,奥森多医疗器械有限公司），游离血红蛋白分析试剂盒（QuantiChrom），分光光度计系统（TECAN SPARK 10M），台式离心机（KA2200，KUBOTA公司），56 ℃孵育箱（SSW型恒温水槽，上海博迅医疗设备厂）。

3 方法

3.1 血样样本采集、保存、红细胞悬液制备、血清倍比稀释，抗原抗体中和试验，ABO正反定型试验，RHD定型试验，抗体效价试验方法均参考《全国临床检验操作规程》[6]。Ortho半自动、全自动血型分析仪和游离血红蛋白分析试剂盒均按照厂商操作说明执行。将上述所有血样的红细胞和血浆分离，每一份再分为“未处理组（对照组）”和“处理组”两组，其中“处理组”红细胞及血浆分别置56 ℃孵育30 min，“未处理组”红细胞及血浆分别置室温30min。

3.2 溶血率检测：血液样本经56 ℃孵育处理后，溶血情况不确定，是否可进行血清学实验并不明确。本研究首先评价56 ℃孵育处理后压积红细胞溶血率。若溶血率不高，血清学实验是可进行的，且结果可靠。血液溶血后会从红细胞释放出游离血红蛋白进入血浆中，通过测定血浆游离血红蛋白量，绘制标准曲线，可计算溶血率。

将1 mL新鲜O型全血血样（血样离心压积后，分别吸取400 μL压积红细胞和600 μL对应血浆，即40%压积红细胞和60%血浆）置-80 ℃冰箱冰冻30 min，取出常温复温后红细胞完全溶血，即得1 mL“溶血液”。取AB型血浆稀释上述“溶血液”，1%至10%“溶血液”10个浓度梯度，使用血红蛋白分析试剂盒，并使用TECAN分光光度计系统检测OD值（400 nm），观察游离血红蛋白量，并绘制溶血标准曲线及公式。随机取20名献血者全血血样，其中男性、女性10名，编成两组：“未处理组”，“处理组”进行实验。标记“未处理组”分别室温放置30 min，再各取1 mL标记“处理组”分别56 ℃孵育30 min后，均使用血红蛋白分析试剂盒检测“未处理组”与“处理组”血浆中游离血红蛋白量。通过上述溶血标准曲线及换算公式计算得到“未处理组”与“处理组”红细胞溶血率。

3.3 A、B、D抗原检测：使用抗原抗体中和试验检测计算A、B、D抗原处理前后变化情况。A、B、D抗原检测（以A型D阳性为例）：将抗-A血型定型试剂用生理盐水稀释至凝胶卡检测强度为“4+W”，制成“标化抗A”试剂分别与“A型未处理组”及“A型处理组”3%红细胞悬液室温下中和反应10分钟，离心后取40 μL上清与ABO反定型试剂红细胞在凝胶卡中反应，使用设备为Ortho半自动血型分析系统。观察并记录两组细胞吸收后标化抗A分别与A、B、O型试剂红细胞反应的凝集强度，并转化为相应分值。O型红细胞作为平行对照组。B型红细胞与标化抗B反应；AB型红细胞分别与标化抗A、标化抗B反应，方法同上。

RhD抗原检测：使用IgM抗-D定型试剂,用生理盐水稀释至凝胶卡检测凝集强度约为“3+S”,分别与56 ℃处理及未处理组做中和试验，中和后抗D与试剂O细胞反应，方法同A、B抗原检测。

3.4 抗原量-凝集强度转化标准曲线的绘制：取多人份A型细胞、B型细胞、RhD阳性细胞分别混合后，配成3%红细胞悬液，用生理盐水稀释成10个浓度梯度，使红细胞浓度分别为3%，2.7%，2.4%，2.1%，1.8%，1.5%，1.2%，0.9%，0.6%，0.3%。用10个浓度梯度红细胞分别与上述“标化抗A”、“标化抗B”、“标化抗D”混合并吸收抗体。经吸收后的标化抗体与相应试剂红细胞反应，记录相应凝胶卡实验的凝集强度，并转换为凝集分值。在Office Excel 软件中绘制A、B、D抗原百分比与吸收后抗体凝集强度关系的标准曲线及趋势线。根据趋势线公式将“未处理组”和“处理组”的相应凝集分值转化为抗原量的变化值。

亚型抗原检测：使用抗-A、抗-B、IgM抗-D、IgG抗-D定型试剂（未经稀释）分别与相应A亚型、B亚型及D变异性血样反应，所有血样分为“处理组”和“未处理组”。分别读取试管法及凝胶卡法结果。

3.5 血型抗体检测：使用全自动血型分析仪（Ortho BioVue System）配合抗-IgG试剂微柱凝集卡法分别检测“未处理组”和“处理组”血浆的抗-A、抗-B效价，O型血浆分别检测抗-A及抗-B，以AB型血浆为对照组。

4 结果统计 以上所有凝集强度均使用计分法统计,实验凝集强度判定方法和计分标准参照美国AABB Technical Manual 第十七版，对照表见表1。效价均取2n，以n值进行计算。未处理组与处理组的差异性使用成对T检验，逐对比较，并根据t界值表得到P值。使用的T检验公式为：=逐对差值的均数 ；

表1 凝集强度与凝集计分对照表

结 果

1 溶血标准曲线 制备1 mL“溶血液”，取AB型血浆稀释上述“溶血液”，从0%，1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%的“溶血液”11个浓度梯度，使用血红蛋白分析试剂盒和TECAN分光光度计系统检测400 nm处的OD值。在Office Excel软件中绘制溶血标准曲线及趋势线公式。拟合趋势线均接近于线性曲线，溶血标准曲线：y=39.03x+0.2454，R2=0.9893。x代表100%（400 μL压积红细胞）溶血后各浓度梯度，y代表各浓度梯度下的检得OD值，详见图1。

随机取20名献血者全血血样，其中男性、女性10名。上海地区献血者平均红细胞比容45%左右，献血者全血中含有10%的血液抗凝剂，故献血者全血中真实压积红细胞为40%左右。因红细胞比容在人群中偏差较大，为了实验数据便于观察计算，将20名献血者全血离心压积，分别吸取800 μL压积红细胞和1200 μL对应血浆，各配成2 mL“全血”进行下述实验。各取1 mL（40%压积红细胞和60%血浆）标记“未处理组”分别室温放置30 min，再各取1 mL标记“处理组”分别56℃孵育30 min后，使用血红蛋白分析试剂盒和TECAN分光光度计系统检测“未处理组”与“处理组”血浆中游离血红蛋白在400 nm处的OD值。与上述全血溶血标准曲线的OD值对比得到溶血率，考虑到“处理组”中压积细胞部分溶血后，血浆量增大，导致游离血红蛋白浓度降低，测得OD值偏小，故按照如下公式转化OD值。公式如下：X=（y-0.2454）/（39.03-2/3 y）。按照处理前原有压积红细胞400 μL和血浆600 μL计算。X代表400 μL压积红细胞经处理后的溶血率，y代表实验检测到的OD值。计算红细胞溶血率平均1.87%±2.02%，处理后溶血最严重的溶血率为：8.59%。详见表2。

图1 溶血标准曲线

表220例溶血率汇总表

2 抗-A、抗-B、抗-D试剂的标化 经效价检测，分别用生理盐水将抗-A、抗-B稀释至“4+W”，均为128倍稀释；将抗-D至“3+S”，为稀释64倍。

3 抗原凝集分值-抗原量百分比标准曲线 Office Excel 软件中绘制A抗原、B抗原、D抗原凝集分值-抗原量百分比标准曲线及趋势线。拟合趋势线均接近于二次项式曲线，A抗原趋势线公式：y= -5.11x2-3.53x+11.27，R2=0.995；B抗原趋势线公式：y=2.66x2-10.02x+11.07，R2=0.965；D抗原趋势线公式：y= -1.51x2-8.29x+11.07，R2=0.984，以上y代表“凝集分值”，x代表“抗原量%”。将各型“未处理组”和“处理组”反应凝集强度代入标准曲线趋势线公式，得到处理前后两组抗原浓度百分比值，计算得抗原孵育前后抗原变化百分率，详见图2。

血液样本经过56℃孵育处理后，红细胞表面A、B抗原浓度表达平均减弱，20例A型A抗原量百分比平均减弱43.8%±23%（表示为：±SD，下文同）；10例AB型的A抗原量百分比平均减弱35.8%±28%；20例B型的B抗原量百分比平均减弱45.0%±25%；10例AB型的B抗原量百分比平均减弱26.7%±36%。孵育后红细胞表面D抗原浓度表达平均增强，20例A型、20例B型、10例AB型、6例O型的D抗原量百分比平均减弱增强111.6%±147%。详见表3。

4 收集研究7例ABO亚型分别：A3、B3、B3、Bx、AB3、AB3、ABmh（AB型类孟买型），以上全部ABO亚型抗原未经孵育前均可在ABO血型正定型卡中被检出。56 ℃孵育后A、B抗原凝集均减弱,其中A抗原（2例）抗原凝集分值平均减弱19.3%±13%；B抗原（6例）抗原凝集强度平均减弱40.1%±30%。其中1例Bx亚型血样在56℃孵育后，正定型B抗原变得不可测得，其他亚型血样在孵育后依然可被正定型试验检出。6例Dv型D抗原凝集分值平均减弱29.6%±22%，其中3例Dv型为IgM抗-D盐水介质减弱型，3例Dv型为IgM抗-D盐水介质阴性反应，使用IgG抗-D试剂在抗球蛋白法中被检出，以上6例Dv型在56 ℃孵育后D抗原表达均减弱，且均可被测得。详见减弱数值可见表4。

5 56℃孵育处理后的血清中抗-A、抗-B效价及计分值均减弱，其中计分值以2n中n值进行抗体效价计算，其中抗-A（B型）处理后血浆、抗-A（O型）处理后血浆、抗-B（A型）处理后血浆、抗-B（O型）处理后血浆的n值分别减弱3.19%、5.49%、3.12%、9.62%。详见表5。

讨 论

图2 A、B、D抗原凝集分值-抗原量百分比标准曲线

表3 各血型抗原孵育处理前后凝集浓度变化汇总表

表4 ABO亚型及D变异型抗原凝集浓度变化汇总表

表5 血浆抗体孵育前后效价与凝集评分值

根据实验数据，血液样本经56℃孵育后,红细胞溶血率平均1.87%±2.02%（按照400 μL压积红细胞计算），最严重溶血为8.59%，可以认为56 ℃孵育处理对血液样本溶血影响并不严重，处理后的血液样本可以进行血清学抗原抗体检测实验。

实验证明血液样本经56℃孵育后，正常献血者A、B抗原凝集强度与抗-A、抗-B效价均有减弱。A抗原凝集浓度百分率减弱至56.2%及64.2%，B抗原凝集浓度百分率减弱至55.0%及73.3%。正常献血者中单个红细胞上A、B抗原表达量均为10.5×105位点/细胞，而A2型个体红细胞上A抗原表达量为2.2×105位点/细胞[7]，目前市售的所有抗-A、抗-B血型定型试剂与各厂商血型正反定型卡正定型卡中抗-A，抗-B试剂效价与亲和力国家有严格要求，保证与A、B抗原表达量20至100万时，反应强度可达“4+”。经过56℃孵育后的常规A、B抗原与市售的正定型试验试剂或反应卡均可达“4+”反应强度。我们实验中的正常献血者A型20例，B型20例，AB型10例经56℃孵育后，正定型试验反应性均达到“4+”，实验结果所示A、B抗原凝集减弱均不足以干扰实验室常规血型正定型试验。

ABO亚型的A、B抗原表达量（＜1.0×105位点/细胞）[7]远低于正常A、B、AB型的抗原表达，我们直接选用试管法正定型检测抗原表达变化。85.7%（6/7例）亚型56℃孵育后抗原凝集计分值虽减弱，但依然可以在正定型试验中被测得。孵育处理后有1例Bx型B抗原（＜0.1×105位点/细胞）在正定型试验中从弱阳性转为无法测得，仅观察正定型试验可被误判为O型，但其反定型抗B抗体凝集不强则提示B亚型可能。56℃孵育处理亚型血样在极限低抗原表达下无法测得，可通过其他辅助实验检出亚型抗原，比如吸收放散试验，基因分型技术等 。血样孵育处理后，正常献血者D阳性抗原凝集分值增强111.6%，D阳性血样抗原凝集强度增强，具体原因尚不明确，笔者猜测可能是热作用下更多D抗原位点被暴露所致。Dv型D抗原凝集分值减弱，6例Dv型孵育处理后均可被IgM抗-D试剂或（或和）IgG抗-D试剂检出。56℃孵育处理对D阳性，D变异型鉴定不受影响。

血样56℃孵育后，66例血样血浆中抗-A（B型22例，O型22例），抗-B（A型22例，O型22例）效价2n中n值降低均不超过10%，所有血样孵育处理后均可测得抗体，实验结果显示孵育处理后抗体减弱，但对血型反定型结果影响不大。见图3。

图3 血浆抗体效价孵育前后计分值对比图

新冠肺炎病毒疫情在全球蔓延，并持续恶化。有报道该病毒存在于新冠患者的血液中，尚未报道病毒经血传播。我们免疫血液学实验室，医院输血科等血清学实验室一般生物安全防护级别较低，一般为P1实验室或参照P2实验室，普遍不具备直接检测含病毒血样能力。我国将新冠肺炎病毒列为二类传染病，管理上按照甲类传染病进行管理，处置该类样本需要负压或加强型P2实验室。疫情之下，各类血型血清学实验室可能会接收大量未明确是否有病毒抗原的血液样本，将血样置于56 ℃孵育30分钟可有效灭活病毒，在不影响血型血清学结果情况下，保护实验人员生物安全。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突