胥明勇，朱华强，吴泳桦，庄利东

（绵阳市中心医院检验科，四川 绵阳 621000）

目前，实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）因其特异好、灵敏度高、快速方便、能有效避免扩增产物污染等优点，已成为分子生物学研究的重要工具[1]。然而，为了确保PCR测定结果准确，必须有严格的室内质控措施[2]。临床实验室进行分子诊断项目室内质控时，应首先考虑质控物稳定性，但目前尚未见基质与检测样本一致的沙眼衣原体（Chlamydiatrachomatis，CT）DNA质控物的相关报道。本PCR实验室利用临床阴、阳性样本制备质控物，并对其稳定性进行评价。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集绵阳市中心医院无血性、无常见其他感染性疾病患者CT DNA为强阳性的宫颈分泌物样本1例，检测循环阈值（cycle threshold，Ct值）为25.53；另收集无血性、无常见其他感染性疾病患者CT DNA阴性宫颈分泌物样本2例，混匀后检测结果为阴性，且内标结果为阳性。

1.2 仪器与试剂

采用ABI 7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）进行检测，CT DNA检测试剂盒购自湖南圣湘生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 质控物制备 将强阳性宫颈分泌物进行56 ℃、30 min灭活后，用阴性样本将强阳性样本15倍稀释后制备成阳性质控物，检测Ct值为30.40；再用阴性样本将阳性质控物15倍稀释后制备成弱阳性质控物，检测Ct值为35.30。将制备好的质控物分装于0.6 mL离心管中，标记后分别于-20 ℃和-70 ℃保存。

1.3.2 稳定性评价 （1）采用2种方法对质控物融解稳定性进行评价。从-20℃冰箱中随机抽取48支样本，随机分为A组和B组，每组各24支样本，A组37 ℃水浴复融15 min，B组室温（22 ℃）放置15 min复融，混匀后每支样本测定1次。另外，再随机抽取2支该质控物样本，37 ℃水浴复融混匀，每支测定2次，再置于-20 ℃冰箱中冷冻保存1 d后再进行测定。如此重复3次，评价融解方式和融解次数对质控物稳定性的影响，并计算融解次数的相对偏差范围。（2）-20 ℃冷冻保存稳定性评价。从-20 ℃冰箱中随机抽取2支样本，每月测定1次，每支样本37 ℃水浴复融混匀检测2次，连续测定3个月。采用一元线性回归方法分析所测数据。（3）-70 ℃冷冻保存稳定性评价。从-70 ℃冰箱中随机抽取2支样本，每2个月测定1次，每支样本37 ℃水浴复融混匀检测2次，连续测定12个月。采用一元线性回归方法分析所测数据。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0软件进行数据分析。融解方式对质控物稳定性影响的计量资料比较采取配对t检验，计数资料比较采用连续校正χ2检验。冷冻保存稳定性评价采取一元线性回归方法进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阳性质控物稳定性评价

2.1.1 融解次数和融解方式对质控物稳定性的影响 复融3次测定Ct值与初次测定Ct值的相对偏差为1.10%～5.03%，其偏差在《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》（CNAS-CL02-A009）文件规定的范围内[3]，说明融解次数对测定结果并无明显影响。对A组和B组进行配对样本t检验，t值为-0.732，P值为0.483，说明融解方式对测定结果并无明显影响。

2.1.2 -20 ℃冷冻保存稳定性评价结果 一元线性回归分析结果显示，在3个月内，质控物随保存时间的延长没有显著趋向变化。见表1。

表1 -20℃冷冻保存稳定性评价结果

2.1.3 -70 ℃保存条件下稳定性评价结果 一元线性回归分析结果显示，在12个月内，质控物随保存时间的延长没有显著趋向变化。见表2。

表2 -70℃保存条件下稳定性评价结果

2.2 弱阳性质控物稳定性评价

2.2.1 融解次数和融解方式对质控物稳定性的影响 复融3次测定Ct值与初次测定Ct值的相对偏差为-5.39%～-4.04%，其偏差在《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》（CNAS-CL02-A009）文件规定的范围内[3]，说明融解次数对测定结果并无明显影响。对A组和B组进行χ2检验，χ2值为4.923，P值为0.027，说明融解方式对测定结果有明显影响。A组和B组均有假阴性结果，其中A组有1例，B组有8例。

2.2.2 -20 ℃冷冻保存稳定性评价结果 一元线性回归分析结果显示，在3个月内，质控物随保存时间的延长没有显著趋向变化。见表3。

2.2.3 -70 ℃保存条件下稳定性评价结果 一元线性回归分析结果显示，在12个月内，质控物随保存时间的延长没有显著趋向变化。见表4。

表3 -20℃冷冻保存稳定性评价结果

表4 -70℃保存条件下稳定性评价结果

3 讨论

CT是一种性传播疾病的病原体，在细胞内寄生，易感染柱状上皮细胞，会引起男、女性生殖道及泌尿道感染，从而导致盆腔炎、输卵管损伤，甚至不孕不育[4]。在CT的诸多检测方法中，实时荧光PCR已经成为医学实验室主要的检测方法，为了得到准确的检测结果，室内质控尤为重要。要做好室内质控，首先要有稳定、可靠的质控物，可应用于医学PCR实验室的质控物应具备以下几个条件[5]：（1）基质与检测样本一致；（2）所含待测物浓度接近实验的控制水平；（3）靶值或者预期结果已定；（4）无已知的生物传染危险；（5）单批可大量获得；（6）有很好的稳定性。本研究制备的质控物基本具备以上条件：质控物基质同样本一致，能够防止质控物基质中的抑制物对检测结果产生影响；制备的阳性质控物能敏感地反映核酸提取有效性；为了确保无常见感染性疾病病原体，将质控物经56 ℃、30 min灭活；一次性可获得使用1年以上的质控物量，可起到长期监测实验室检测质量的作用。

目前，医学实验室常见的CT DNA质控物一般为尿液、细胞培养物和含有单一目的片段的质粒，均存在不同缺点[6]。因临床常见样本为生殖道分泌物，若质控物为尿液样本，其基质与检测样本不一致，可能对常规质控产生影响。细胞株作为质控物有许多优点，如能够模拟临床样本进行全程监控、稳定性好、无生物传染性等[7]，但其制备的周期长、成本较高。若质控物以质粒作为样本，不需要裂解提取所需要的模板，无法模拟临床样本提取过程，所以起不到全程质控的作用。本实验室制备的CT DNA质控物均能避免这些缺点。

Ct值是实时荧光PCR扩增过程中荧光信号达到指数扩增时的循环数，其大小与病原体载量呈负相关[8]。蒋义等[9]在血液病毒核酸筛查室内质控方法的研究中发现，质控物浓度与Ct值呈高度相关，因此Ct值能够作为实时荧光PCR定量参数，也可以作为统计学计量资料。根据CNAS-CL02-A009文件规定[3]：定性检测项目每次试验应设置阴性、弱阳性和/或阳性质控物，因此将质控物制备成阳性和弱阳性进行评价，符合实验室室内质控的要求。

本研究制备的质控物评价结果表明，阳性和弱阳性质控物复融3次对测定结果并无明显影响；阳性和弱阳性质控物在-20 ℃冷冻保存3个月和-70 ℃冷冻保存12个月，随保存时间的延长没有显著趋向变化，说明质控物在该温度下保存稳定。在室温（22 ℃）、37 ℃水浴条件下复融，各随机抽取48支阳性和弱阳性质控物样本，随机分为A组和B组，每组各24支样本，进行复融方式评价，结果显示，阳性质控物检测结果全部为阳性，统计学分析结果显示，复融方式对检测结果无影响。弱阳性质控物在37 ℃水浴条件下复融混匀检测，有1例假阴性样本，而在室温（22 ℃）条件下复融混匀检测，却有8例假阴性样本，提示弱阳性分泌物样本复融应采取37 ℃水浴融解方式，其稳定性最好。弱阳性质控物在2种条件下复融后均出现了假阴性结果，即使在其他条件下的稳定性评价结果是通过，也不能应用于医学实验室。产生假阴性结果的原因可能与细胞本身易聚集黏附的性质有关[10]，还可能与质控物本身浓度高低有关[11]，具体分析后，推测原因可能为：（1）37 ℃水浴可能会消除细胞间以及细胞与管壁之间聚集黏附问题，基本上不会造成漏取感染细胞，而室温（22 ℃）融解却不能完全消除细胞聚集黏附问题，可能会漏取感染细胞；（2）阳性质控物比弱阳性质控物浓度高，即使漏取少许感染细胞也不影响定性结果，而弱阳性质控物本身浓度低，漏取少许感染细胞有可能会导致假阴性结果。标准物质在保证核酸检测准确性方面起非常重要的作用[12]，当阳性质控物检测结果为假阴性时，通过检测该标准物质能够尽快查找失控原因。

本研究制备的质控物基质与检测样本相同，能够防止基质效应的影响，而且制备质控物样本易收集，能够单批大量获得，从而极大地降低成本。阳性质控物因稳定性达到标准，可以应用于临床实验室，能起到监测实验室检测质量的作用。

本研究不足之处在于在评价融解次数和冷冻保存对稳定性的影响方面，质控物评价样本量不足，不能完全保证评价准确性，后续研究将扩大样本量，以得到更科学、更客观的结果。