高伟霞，秦小菀，刘 阳，张 靖，丁显春

（1.南阳市中心医院急诊儿科，河南 南阳 473009；2.南阳市中心医院儿科一病区，河南 南阳 473009；3.南阳市中心医院新生儿科，河南 南阳 473009；4.南阳市中心医院儿科三病区，河南 南阳 473009）

支气管哮喘是一种常见呼吸道慢性病，以慢性气道炎症和气道高反应性为特征，病情迁延、反复发作、难以根治[1]，极大地影响了患儿健康，甚至危及生命，给社会和家庭带来严重负担。嗜酸性粒细胞、肥大细胞等多种炎性细胞和细胞因子，以及免疫功能失衡在儿童支气管哮喘发病过程中起重要作用。T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白-3（T cell immunoglobulin and mucin 3，Tim-3）mRNA已被证实为哮喘易感基因，特异性表达于活化的辅助性T细胞（T helper cell，Th）1及Th17表面，在慢性病毒感染、自身免疫性疾病及变态反应中发挥重要作用，Tim-3 mRNA具有调节Th1/Th2细胞平衡的作用，而Th1/Th2细胞的功能失衡是引发支气管哮喘的重要原因[2-3]。目前，对于儿童支气管哮喘与炎症反应关系的报道较多，但对于诱导痰中炎性细胞类型及炎症相关细胞因子的报道相对较少。本研究通过检测支气管哮喘患儿诱导痰中炎性细胞类型、Tim-3 mRNA以及白细胞介素（interleukin，IL）-2、IL-4、IL-10、IL-13和干扰素γ（interferon gamma，IFN-γ）等多种炎症相关细胞因子表达水平，分析其对儿童支气管哮喘病情监测、疗效评估以及与儿童支气管炎（不合并哮喘）的鉴别诊断价值，以期为儿童支气管哮喘的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2017年3月—2019年4月南阳市中心医院54例支气管哮喘患儿（研究组），其中男童29例（1～6岁18例、7～14岁11例），女童25例（1～6岁13例、7～14岁12例）。所有入选患儿均符合儿童支气管哮喘诊断标准[4]。按哮喘发作期严重程度将研究组患儿分为轻度哮喘组（14例）、中度哮喘组（24全例）、重度哮喘组（16例）。选取同期在南阳市中心医院接受治疗的年龄相当的支气管肺炎（不合并哮喘）患儿42例作为对照组，其中男童23例（1～6岁12例、7～14岁11例）、女童19例（1～6岁11例，7～14岁9例）。2个组患儿在年龄、性别方面差异无统计学意义（P＞0.05）。

所有研究对象入选标准：年龄1～14岁，患儿家属知情同意，通过南阳市中心医院伦理委员会审批，患儿近6个月内无糖皮质激素治疗史，无心、肝、肾等重要脏器疾病。排除标准：有重要脏器及器质性病变者有糖皮质激素治疗史者，精神疾病者。

1.2 治疗方案

对照组给予常规综合治疗，包括止咳化痰、退热、抗感染、补液治疗等，另给予喜炎平联合布地奈德超声雾化治疗，具体方法为：喜炎平（25 mg/次）+布地奈德混悬液1 mL（含布地奈德0.5 mg）+0.9%氯化钠溶液3 mL，超声雾化吸入10 min。所有患儿根据具体情况进行祛痰、吸氧、解除痉挛、抗感染等对症治疗，吸入用布地奈德混悬液4 mL（英国AstraZeneca公司，批号为LOT330452）、硫酸特布他林雾化液2 mL（英国AstraZeneca公司，批号为BBCT），每日2次，每次面罩吸入时间为15 min，氧流量为4～5 L/min。

1.3 诱导痰的收集与处理

以3%高渗氯化钠溶液对受试对象进行15 min雾化，然后用矿泉水漱口至咳出痰液，将痰液收集至消毒平皿中，于4 ℃保存备用。将透明且密度较高的痰液放入Eppendorf管中称重，并加入4倍体积、0.1%二硫苏糖醇试剂（DL-dithiothreitol，DTT），震荡10 min充分混匀，然后37 ℃水浴10 min，经200目筛网过滤杂质，以450×g离心12 min，将上清液置于-80 ℃冰箱保存备用。沉淀的细胞用于细胞形态学检查和Tim-3 mRNA检测。

1.4 方法

1.4.1Tim-3 mRNA水平检测 采用RNA抽提试剂盒（北京安图生公司）提取总RNA，逆转录后经逆转录聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增后，将扩增产物置于-80 ℃冰箱中保存备用。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性20 s，56 ℃退火40 s并延伸30 s，重复39个循环；重复3次，取平均值。

1.4.2 IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ水平检测 将诱导痰上清液严格按照酶联免疫吸附试验试剂盒（美国R&D公司）说明书进行操作，使用Sun-rise酶标仪（奥地利Tecan公司）检测各炎症相关因子水平。

1.4.3 炎性细胞检测 使用Olympus BX53显微镜（日本Olympus公司）检测各种炎性细胞，并计算其百分比。

1.5 疗效评定标准[5]

疗效分为显效、有效、无效。显效指咳嗽、喘憋、气促等哮喘症状明显缓解，第1秒最大呼气量（forced expiratory volume in 1 second，FEV1）增加率≥25%；有效指哮喘症状有所缓解，肺部哮鸣音和湿啰音基本消失，FEV1增加率为15%～24%；无效指未达到上述标准。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，计量资料采用±s表示，组间比较使用t检验；计数资料用例（率）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析使用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前各组诱导痰中炎性细胞类别、Tim-3 mRNA以及炎症相关细胞因子比较

治疗前，研究组诱导痰中嗜酸性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、Tim-3 mRNA、IL-4、IL-13、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-10比值均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；IL-2、IL-10及Th1/Th2均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.2 不同严重程度哮喘患儿诱导痰中Tim-3 mRNA和炎症相关细胞因子水平比较

中度哮喘组、重度哮喘组患儿嗜酸性粒细胞百分比、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、Tim-3 mRNA、IL-4、IL-13、IFN-γ水平及IFN-γ/IL-10高于轻度哮喘组、对照组患儿，差异有统计学意义（P＜0.05）。而IL-2、IL-10、IFN-γ水平及Th1/Th2低于轻度哮喘组和对照组患儿，差异有统计学意义细胞（P＜0.05）。见表1。

表1 不同严重程度哮喘患儿诱导痰中炎性细胞及相关细胞因子水平比较 ±s

表1 不同严重程度哮喘患儿诱导痰中炎性细胞及相关细胞因子水平比较 ±s

注：与对照组比较，*P＜0.05；与轻度哮喘组比较，#P＜0.05；与中度哮喘组比较，△P＜0.05。

组别 嗜酸性粒细胞百分比/%中性粒细胞百分比/%单核细胞百分比/%淋巴细胞百分比/%Tim-3 mRNA IL-4/（pg/mL）对照组 8.86±1.39 50.85±8.22 25.94±9.42 10.94±6.35 0.28±0.11 31.96±5.77研究组 19.22±5.16* 52.92±13.85 24.45±12.55 19.48±3.94* 0.63±0.09* 41.33±9.05*轻度哮喘组 10.32±2.61* 41.63±7.03 34.03±8.44 11.45±2.36 0.34±0.11 23.01±5.02中度哮喘组 18.64±3.22*# 67.32±10.28*# 35.83±6.97 18.42±1.84*# 0.59±0.07*# 38.44±5.16*#重度哮喘组 24.98±3.24*#△ 72.35±4.00*# 39.21±2.14 22.38±1.82*# 0.72±0.10*#△ 42.56±7.65*#组别 IL-13/（ng/mL） IL-2/（pg/mL） IL-10/（ng/mL） IFN-γ/（pg/mL） IFN-γ/IL-10 Th1/Th2对照组 114.31±18.94 190.94±21.90 221.35±54.88 32.41±8.29 0.15±0.05 6.78±1.09研究组 140.28±31.85* 139.12±24.82* 170.64±41.20* 49.54±14.63* 0.31±0.09* 3.74±0.83*轻度哮喘组 99.85±13.94 189.43±16.43 220.81±21.39 39.69±7.08 0.17±0.08 4.58±0.45*中度哮喘组 122.85±20.45 140.06±16.53*# 165.34±20.38*# 44.87±7.92*# 0.25±0.11*# 3.62±0.51*#重度哮喘组 148.62±19.35*# 118.63±17.44*# 152.97±19.57*# 51.82±9.15*# 0.33±0.08*#△ 3.01±0.43*#△

2.3 不同治疗效果患儿治疗前、后诱导痰中炎症相关细胞因子水平比较

研究组患儿治疗有效48例（有效组）、无效6例（无效组），总有效率为88.89%（48/54）。分析2组治疗前、后炎症相关细胞因子水平，发现无效组治疗后淋巴细胞百分比、IL-4和IL-13均低于治疗前，而IL-2、IL-10、IFN-γ、IFN-γ/IL-10及Th1/Th2高于治疗前，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；有效组治疗后嗜酸性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、IL-4、IL-13、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10均低于治疗前，而IL-2、IL-10、Th1/Th2高于治疗前，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。治疗后，有效组嗜酸性粒细胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10比值低于无效组，而Th1/Th2高于无效组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 不同治疗效果患儿治疗前、后诱导痰中炎性细胞及相关细胞因子水平比较 ±s

表2 不同治疗效果患儿治疗前、后诱导痰中炎性细胞及相关细胞因子水平比较 ±s

注：与无效组治疗后比较，*P＜0.05；与各组治疗前比较，#P＜0.05。

组别 例数 嗜酸性粒细胞百分比/%中性粒细胞百分比/%单核细胞百分比/%淋巴细胞百分比/% Tim-3 mRNA IL-2/（pg/mL）无效组 6治疗前 19.69±4.74 50.55±7.04 23.99±13.11 18.03±4.44 0.70±0.10 141.39±30.55治疗后 16.29±5.44# 53.25±10.06 22.83±11.26 13.85±4.13# 0.62±0.09 179.33±49.20#有效组 48治疗前 19.01±5.92 51.86±7.96 24.02±12.26 19.48±3.94 0.73±0.09 139.03±29.94治疗后 8.02±3.79*# 53.83±9.26 22.30±10.68 12.39±4.13# 0.42±0.11*# 180.63±39.97#组别 IL-4/（pg/mL） IL-10/（ng/L） IL-13/（ng/L） IFN-γ/（pg/mL） IFN-γ/IL-10 Th1/Th2无效组治疗前 40.94±10.11 168.54±53.82 139.15±33.78 49.33±15.98 0.32±0.09 3.62±0.96治疗后 36.72±9.02# 217.88±49.68# 111.76±30.02# 39.78±16.35# 0.20±0.05# 4.92±1.11#有效组治疗前 41.59±9.76 171.39±51.48 141.75±30.96 50.41±14.63 0.34±0.07 3.80±1.07治疗后 34.19±9.23# 214.53±43.37# 114.04±29.89# 25.38±15.86*# 0.12±0.04*# 5.67±1.22*#

2.4 诱导痰中炎性细胞类型、炎症相关细胞因子与儿童哮喘的关系

以是否出现支气管哮喘（是为1，否为0）为因变量做Logistic回归分析，结果显示，嗜酸性粒细胞百分比[比值比（odds ratio，OR）=2.102，95%可信区间（cofidence interval，CI）为1.097～7.036，P=0.011]、Tim-3 mRNA（OR=1.936，95%CI为1.227～7.218，P=0.023）、IFN-γ（OR=0.476，95%CI为0.292～0.714，P=0.013）、IL-10（OR=0.357，95%CI为0.261～0.684，P=0.015）、IFN-γ/IL-10（OR=0.444，95%CI为0.352～0.729，P=0.004）及Th1/Th2（OR=0.487，95%CI为0.339～0.859，P=0.009）为儿童支气管哮喘的影响因素。

2.5 嗜酸性粒细胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ及IFN-γ/IL-10、Th1/Th2对儿童支气管哮喘与支气管肺炎（不合并哮喘）的鉴别诊断价值

以是否为支气管哮喘作为因变量[1为儿童支气管哮喘，0为支气管肺炎（不合并哮喘）]，以对照组、研究组之间存在差异的指标作为自变量，绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线。ROC曲线分析结果显示，嗜酸性粒细胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10、Th1/Th2对儿童支气管哮喘与支气管肺炎（不合并哮喘）的鉴别诊断具有一定的价值。见图1和表3。

图1 嗜酸性粒细胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ及IFN-γ/IL-10、Th1/Th2诊断儿童支气管哮喘的ROC曲线

表3 嗜酸性粒细胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10和Th1/Th2鉴别诊断儿童支气管哮喘的效能

3 讨论

儿童支气管哮喘是由多种炎性细胞及炎症相关细胞因子共同作用导致的异质性呼吸道慢性炎症性疾病，呼吸道炎症和呼吸道高反应性是该病的基本病理特征[6]。支气管哮喘的发生率及病死率不断上升，严重影响患儿生长发育及身心健康。诱导痰细胞学检查是气道炎症重要标志物检测及疾病治疗指导的主要方法，该方法安全、有效、重复性好、对人体无损害。有研究结果显示[7]，诱导痰中嗜酸性粒细胞不断增多与哮喘患者激素治疗不足或对激素治疗存在耐受等有关；当诱导痰中的嗜酸性粒细胞百分比＞2.5%时，提示存在支气管炎症。本研究结果显示，无论是儿童支气管肺炎还是支气管哮喘，诱导痰中的嗜酸性粒细胞百分比均＞2.5%，且支气管哮喘患儿诱导痰中的嗜酸性粒细胞百分比明显高于支气管肺炎患儿。在哮喘急性期发作患者中，嗜酸性粒细胞百分比明显高于非急性期发作患者，表明嗜酸性粒细胞水平变化与哮喘发作存在相关性[8]。本研究结果显示，儿童支气管哮喘越严重，嗜酸性粒细胞百分比越高；经药物治疗后，嗜酸性粒细胞百分比下降，提示其可能与支气管哮喘控制良好存在相关性。本研究通过Logistic回归分析发现，嗜酸性粒细胞百分比为儿童支气管哮喘的重要参考指标，ROC曲线分析结果显示，嗜酸性粒细胞百分比可作为儿童支气管哮喘与儿童支气管肺炎（不合并哮喘）鉴别诊断的指标，可为临床进一步有效鉴别诊断这2种疾病提供参考依据，建议临床进一步进行多样本、多中心研究。

淋巴细胞在多种慢性呼吸道炎症性疾病中发挥作用，淋巴细胞分泌的炎症因子，如IFN-γ、IL-4、IL-10等在气道炎症反应的发生、发展中起重要作用[9]，淋巴细胞又可分为T细胞、B细胞及自然杀伤细胞，每种细胞类型及其分泌的细胞因子在气道炎症反应中的作用不尽相同。本研究结果显示，支气管哮喘患儿淋巴细胞百分比高于支气管肺炎（不合并哮喘）患儿。

本研究还发现，支气管哮喘患儿诱导痰中IL-2、IFN-γ明显低于支气管肺炎（不合并哮喘）患儿；经治疗后，支气管哮喘患儿IL-2、IFN-γ水平均显著高于治疗前，提示IL-2、IFN-γ水平可能成为支气管哮喘重要的疗效评估指标；支气管哮喘患儿IL-2、IFN-γ水平明显低于支气管肺炎（不合并哮喘）患儿，用ROC曲线进一步评价IL-2、IFN-γ在支气管哮喘与支气管肺炎（不合并哮喘）鉴别诊断中的作用，结果显示IFN-γ对支气管哮喘与支气管肺炎（不合并哮喘）的鉴别诊断具有一定的价值。Th1/Th2免疫功能失衡是诱导儿童支气管哮喘发病的重要原因[10]，本研究结果显示，研究组Th1/Th2低于对照组（P＜0.05），说明支气管哮喘患儿存在Th1/Th2失衡，与既往研究结果[11]一致。Th1能分泌IL-2和IFN-γ，机体内IFN-γ具有增强巨噬细胞介导的抗感染免疫反应，对体内病原体感染有抑制作用，可增强巨噬细胞对病原体的杀伤能力[12]，IL-2可与IFN-γ共同作用，对IgE的生成及Th2克隆均具有一定的抑制作用[13]，Th2可分泌IL-4[11]，IL-4可以作用于B细胞，产生IgE，具有改变B细胞产生类型，诱发哮喘[14]。Tim-3优先表达在Th1，其与配体相互作用可负调节Th1介导的免疫应答[3]，因而Tim-3可辅助性调控Th1/Th2的平衡，发挥免疫调控功能，其导致的机体免疫炎症反应可引发哮喘[15]，在变应性哮喘患者中存在Th1/Th2的不平衡，且与CD4+T细胞上Tim-3的表达上调有关[16]。

本研究结果显示，支气管哮喘患儿Th1/Th2明显低于支气管肺炎（不合并哮喘）患儿，ROC曲线分析结果显示，Th1/Th2对于儿童支气管哮喘与支气管肺炎（不合并哮喘）的鉴别诊断有一定的价值。IL-10是目前公认的炎症与免疫抑制因子[17]，作为淋巴细胞合成的抑制因子，具有抑制自然杀伤细胞或者T细胞活化的作用，其水平下降会导致哮喘加重[18]；IL-13则是被公认的一种独立参与哮喘的有致炎作用的Th2型细胞因子[19]。本研究结果显示，支气管哮喘患儿诱导痰中Tim-3 mRNA、IL-4、IL-13水平高于支气管肺炎（不合并哮喘）患儿，而IL-10水平低于支气管肺炎（不合并哮喘）患儿。Logsitic回归分析结果显示，IL-10、Tim-3 mRNA与支气管哮喘存在显著相关性。ROC曲线分析结果显示，Tim-3 mRNA对支气管哮喘与支气管肺炎（不合并哮喘）有一定的鉴别作用，提示Tim-3 mRNA作为Th2细胞因子之一，具有鉴别支气管哮喘与支气管肺炎（不合并哮喘）的作用。

促炎性因子主要有IL-12、IFN-γ、IL-17等，而抗炎因子有IL-4、IL-10等。为了研究促炎-抗炎细胞因子在儿童支气管哮喘中的作用，本研究对比了IFN-γ/IL-10在儿童支气管哮喘及支气管肺炎（不合并哮喘）中的表达差异，发现治疗后支气管哮喘患儿抗炎因子IL-10水平明显升高，而IFN-γ、IFN-γ/IL-10水平下降。ROC曲线分析结果显示，IFN-γ/IL-10对支气管哮喘及支气管肺炎（不合并哮喘）的鉴别诊断有一定的价值。为了进一步分析促炎、抗炎因子对治疗效果的评价意义，本研究对治疗有效和无效患儿进行了治疗前、后的促炎、抗炎因子水平比较，发现有效组治疗后嗜酸性粒细胞百分比、Tim-3 mRNA、IFN-γ、IFN-γ/IL-10、Th1/Th2与无效组存在差异，提示上述几种指标对于支气管哮喘疗效评估有一定的价值。

综上所述，支气管哮喘患儿诱导痰中炎性细胞类型及炎症相关细胞因子能较好地鉴别支气管哮喘和支气管肺炎（不合并哮喘），嗜酸性粒细胞百分比、Tim-3 mRNA及IFN-γ对支气管哮喘疗效评估、鉴别诊断具有一定作用，同时诱导痰检测具有无创、操作方便的优势，有利于儿童接受，值得在临床中推广。