张中文，左祥荣，郑绪辉，曹 权，李新立，李艳秀

（1.南京医科大学附属江宁医院肝胆胰外科，江苏 南京 211100；2.南京医科大学第一附属医院a.重症医学科，b.心血管内科，江苏 南京 210029）

心力衰竭（心衰）是各种心血管疾病的终末阶段，随着社会人口老龄化的不断发展，心衰患者的发病率和死亡率也在不断升高。《中国心血管病报告2018》显示，推算我国现约有2.9 亿心血管疾病患者，其中心衰患者约为450 万，人均5 个人中就有1 个人罹患心血管疾病，且因心血管疾病死亡的人数明显高于肿瘤以及其他疾病，在居民死亡构成中的占比超过40%。美国的流行病学研究结果显示，美国大约有510 万的心衰患者，且该患病率还在逐年升高[1-2]。大量数据表明，遗传和环境因素共同参与了心衰的发生、发展[3-6]。急性心衰通常起病急骤，病情发展快，属于心血管内科的急危重症疾病，是导致心内科患者死亡的主要原因之一。

单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism,SNP）位点rs12696304 位于3q26 染色体上[7]。较多学者均对rs12696304 位点基因多态性与冠心病、高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病间的相关性进行了研究[8-10]，发现rs12696304 位点基因多态性与冠心病的发生率增加及舒张压升高有关[11]。然而，目前有关rs12696304 位点基因多态性与心衰间相关性的研究报道较少。本研究对336 例急性心衰患者进行基因分型，并对所有患者进行为期1 年的前瞻性随访，以探讨rs12696304 位点基因多态性与中国南方汉族老年人群中急性心衰患者1 年预后间的相关性。

对象与方法

一、对象

选取2012 年3 月至2016 年4 月期间，在南京医科大学第一附属医院心血管内科住院的336 例急性心衰患者，其中女性114 例（33.9%），男性222 例（66.1%）；平均年龄为（61±16）岁，均为我国南方汉族人群，且无亲缘关系。所有患者的诊断均符合中华医学会心血管病学分会制定的中国急性心衰诊断标准[12]。本研究的排除标准如下。①年龄小于18 岁的患者；②有恶性肿瘤病史者；③合并自身免疫病的患者；④存在认知功能障碍的患者；⑤不能配合完成随访的患者。所有患者入院后均由专业的心血管内科医师进行评估，并根据2016 年欧洲急性心衰诊治指南给予标准化的抗心衰规范化治疗。本研究经南京医科大学第一附属医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署书面知情同意书。

二、方法

1.临床资料收集：收集患者的病史和人口学资料，包括性别、年龄、身高、体重、急性心衰病因、伴随疾病情况等。于入院第2 日，患者在清晨空腹状态下经肘静脉采血，测定相关临床血液学指标，同时记录患者的美国纽约心脏协会（New York Heart Association，NYHA）心功能分级、住院期间用药和治疗情况、二维超声心动图检查结果等信息。

2.外周血DNA 提取：采集患者的外周静脉血5 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用血液基因组DNA 提取试剂盒(离心柱型) [购自天根生化科技（北京）有限公司]提取外周血中的DNA,并检测外周血DNA 样本吸光度（absorbance，A）260nm/A280nm的比值，确定其均在1.7～1.9 之间，以保证DNA 的纯度及质量。

3.基因分型：采用TaqMan 荧光探针实时定量聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction，PCR）技术，对外周血DNA 中的rs12696304 位点进行检测。探针及引物混合物能检测到包含rs12696304的核心序列为5′-GCGATCTTAGATCACCTTGAGTAAA[C/G]TGAGGCTTACTGAAGCTGAGC-3′（赛默飞世尔科技公司）。PCR 反应体系为5 μL，包括TaqMan 通用PCR 反应预混液 （TaqPath ProAmp Master Mix）2.5 μL，探针0.25 μL，DNA 模板11.25 ng（5 ng/μL）。反应条件为，95 ℃10 min；95 ℃15 s、60 ℃1 min，共40 个循环；4 ℃下保存。TaqMan PCR 扩增产物最后经美国应用生物系统公司PRISM 7900HT 荧光定量PCR 仪的等位基因区分（Allelic Discrimination）程序进行终点读板分析，完成基因分型。

4.随访：依据基因分型结果对患者进行分组，并在患者出院后的第3、6、9、12 个月通过门诊或电话方式进行随访，随访期间不对患者采取特殊的干预措施。终点事件定义为自入组当日至1 年内发生的全因死亡。

三、统计学处理

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析，计量资料采用方差分析(One-Way ANOVA)或非参数检验，以均数±标准差（±s）或中位数（P25，P75）表示；计数资料采用卡方检验，以频数或百分比表示；采用Kaplan-Meier 法和log-rank 检验，评估不同遗传模型下不同基因型对急性心衰患者生存率的影响。3 种遗传模型（共显性、显性、隐性模型）被用于评估rs12696304 基因多态性与急性心衰患者预后之间的关系。采用多因素Cox 回归分析评估不同遗传模型下影响急性心衰患者死亡的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。采用在线SHEsis 分析软件[13]对rs12696304 位点进行Hardy-Weinberg 平衡检验，P＞0.05 说明符合遗传平衡。

结 果

一、基因分型及Hardy-Weinberg 平衡检验

336 例急性心衰患者的rs12696304(G＞C)基因分型结果为，GG 型157 例，占46.7%；CG 型143 例，占42.6%；CC 型36 例，占10.7%。C 等位基因频率为32.0%，基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05），提示本研究对象具有群体代表性。3 种不同基因型患者间1 年的总体死亡率差异无统计学意义（P＞0.05），但携带不同等位基因急性心衰患者间的死亡率差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。

二、不同遗传模型下各基因型患者的基线资料

1.共显性遗传模型下各基因型患者基线资料比较：人口学特征及生化指标在3 种基因型总体之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。组间比较结果显示，CC 基因型患者的体质量指数高于GG基因型患者(P＜0.05），CC 基因型患者的心率低于GG 基因型患者（P＜0.05）（见表2）。主要超声心动图指标、急性心衰病因和伴随疾病情况在各基因型患者间的差异无统计学意义 （P＞0.05）（见表3、4）；3 种基因型患者住院期间使用口服利尿剂、地高辛及左西孟旦情况差异有统计学意义（P＜0.05）（见表4）。

2.显性和隐性遗传模型下各基因型患者基线资料比较：显性遗传模型下，人口学特征及生化指标在不同基因型间比较，差异无统计学意义 （P＞0.05）（见表5）。各基因型患者的伴发疾病比较，结果显示，CG+CC 基因型组中有糖尿病和吸烟史者所占百分比高于GG 基因型组；主要超声心动图指标、急性心衰病因和NYHA 心功能分级在各基因型患者间的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表6）。不同基因型患者的住院期间用药情况进行比较，结果显示，CG+CC 基因型组与CC 基因型组间使用口服利尿剂及地高辛的情况差异有统计学意义（P＜0.05）（见表7）。

表1 Hardy-Weinberg 平衡检验及基因型和等位基因频率估计[n（%）]

表2 共显性遗传模型下各基因型急性心衰患者的人口学特征和生化指标比较

表3 各基因型患者的NYHA 心功能分级、超声心动图指标、病因及伴发疾病比较[n(%)]

表4 各基因型患者住院期间的用药情况比较[n(%)]

隐性遗传模型下，比较人口学特征及生化指标，结果显示，GG+CG 基因型患者的谷草转氨酶（U/L）水平高于CC 基因型患者（P＜0.05）（见表5）；各基因型患者NYHA 心功能分级、超声心动图指标、病因及伴发疾病在各基因型患者间的差异无统计学意义（P＞0.05）（见表6）；对各基因型患者的住院期间用药情况进行比较，结果显示，CC 基因型组与GG+CG 基因型组间螺内酯、地高辛、左西孟旦、阿司匹林的使用情况差异有统计学意义（P＜0.05）（见表7）。

三、不同遗传模型下rs12696304 基因多态性对急性心衰患者生存率的影响

Kaplan-Meier 生存曲线分析结果显示，共显性遗传模型中，杂合子CG 基因型患者的1 年生存率（74.8%）较GG 基因型（85.4%）明显下降（P＜0.05）；在显性遗传模型（CG+CC 比GG）中，CG+CC 基因型急性心衰患者的生存率 （74.9%） 较GG 基因型（85.4%）患者明显降低（P＜0.05）；在隐性遗传模型下（CC 比CG+GG），各基因型急性心衰患者的1 年生存率差异无统计学意义（P＞0.05）（见图1）。

表5 显性和隐性遗传模型下各基因型急性心衰患者的人口学特征和生化指标比较

四、多因素Cox 回归分析

为了进一步验证rs12696304 基因多态性是否与急性心衰患者的预后独立相关，本研究对该SNP位点在Kaplan-Meier 分析中有统计学意义的2 种不同的遗传模型 （共显性遗传模型和显性遗传模型）分别进行了多因素Cox 回归分析。以急性心衰患者1 年内是否死亡为因变量，将年龄、性别和基线资料组间比较中差异有统计学意义的临床变量（共显性遗传模型：体质量指数、心率、NYHA 心功能分级、是否使用口服利尿剂及地高辛和左西孟旦；显性遗传模型：是否合并糖尿病，是否吸烟，是否使用口服利尿剂及地高辛）作为协变量进行多因素Cox 回归分析，设定野生基因型GG 为参考基因型。结果显示，在共显性遗传模型下，杂合子CG 基因型急性心衰患者的1 年死亡风险较野生GG 基因型患者明显增高（P＜0.05），死亡的风险比（hazard ratio，HR）为2.45（95%CI 为1.22～4.95）；在显性遗传模型下，等位基因CC+CG 基因型急性心衰患者发生1 年死亡的风险为GG 基因型患者的2.45 倍（95%CI 为1.24～4.84），差异有统计学意义（见表8）。结果提示，rs12696304 基因多态性是影响急性心衰患者1 年内预后的独立危险因素。

表6 显性和隐性遗传模型下各基因型患者的NYHA 心功能分级、超声心动图指标、病因及伴发疾病比较[n(%)]

表7 显性和隐性模型下不同基因型患者住院期间的用药情况比较[n(%)]

图1 不同遗传模型下各基因型患者的生存曲线

讨 论

心力衰竭的发生、发展是一个由多种因素驱动的复杂病理生理过程，不仅与环境因素有关，遗传因素也在其中起着不可或缺的作用[14-16]。目前已经发现较多SNP 位点与心力衰竭间存在相关性[3-4]，如2010 年2 项有关心力衰竭的研究分别发现，位于LRIG3 基因及USP3 基因上的2 个SNP 位点与心力衰竭的发生、发展有关，而另一个涉及CMTM7基因的SNP 与心力衰竭患者的死亡率上升有关，并且上述几个SNP 的相对危险度均为1.5 左右。

本研究假设SNP 位点rs12696304 与中国南方汉族老年人群的急性心衰预后有关，并展开分析，结果显示，在共显性遗传模型下，携带杂合子CG基因型急性心衰患者的1 年生存率较GG 基因型患者明显下降；而在显性遗传模型下，携带等位基因C 的CG 或CC 基因型急性心衰患者的1 年生存率较携带野生GG 基因型患者明显下降。导致不同遗传模型下各基因型急性心衰患者的1 年生存率存在差异的原因目前尚不明确，其可能与不同遗传模型下各基因型患者的急性心衰发生、发展过程以及临床表型存在差异有关。本研究进一步行多因素Cox 回归分析后发现，在共显性遗传模型下rs12696304 位点的CG 杂合子基因型以及在显性遗传模型下rs12696304 位点的CG 基因型、CC 基因型均为预测急性心衰患者预后的独立危险因素。在共显性遗传模型下，CG 基因型急性心衰患者的1 年死亡风险是GG 基因型患者的2.45 倍（95%CI 为1.22～4.95）；在显性遗传模型下，携带CG+CC 基因型急性心衰患者的死亡风险是GG 基因型患者的2.45 倍（95%CI 为1.24～4.84），与Kaplan-Meier 生存分析的结果一致。

表8 rs12696304 在不同遗传模型下的多因素Cox 回归分析

文献报道，位于染色体3q26 上的rs12696304位点基因多态性与端粒长度有关，参与了端粒长度的调节。并有研究显示，端粒长度缩短参与了年龄相关性疾病（如冠心病、动脉粥样硬化、高血压病、心力衰竭等）的发生、发展，由此可以推测，rs12696304位点的基因多态性影响急性心衰患者预后的机制，可能与其影响不同基因型急性心衰患者的端粒长度有关[7-10]。本研究纳入的急性心衰患者的平均年龄大于60 岁，故本研究结果可能为预测老年急性心衰患者的预后提供新的思路，尤其是为中国南方汉族老年急性心衰人群的预后提供遗传背景上的支持。

总之，检测rs12696304 位点基因多态性可能有助于评估急性心衰患者1 年的预后情况。然而，本研究未对不同基因型急性心衰患者的端粒长度进行测定，关于rs12696304 位点基因多态性是通过影响端粒长度还是其他机制影响着急性心衰患者的预后，还需要后续进一步深入研究。此外，本研究的样本量偏小，研究结果可能存在偏倚，后续有必要扩大样本量以进一步验证。