杨姗姗,申风俊

(山西医科大学第一医院消化科,太原 030001;*通讯作者,E-mail:919016603@qq.com)

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是慢性肝病向肝硬化进展的早期的、可逆的、复杂的病理生理阶段。研究表明,肝脏中存在局部肾素-血管紧张素系统(RAS),正常生理状态下,肝脏中即能检测出RAS相关成分,而病理状态下其含量亦会发生变化[1]。肝脏损伤时,局部RAS的激活可通过血管紧张素转化酶(ACE)-血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)-血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)经典轴,促进肝纤维化及肝脏炎症的进展,AngⅡ作为经典轴中的重要效应因子,可诱导ROS大量产生,作用至关重要[2]。肝纤维化的发展与氧化应激密切相关,过量的活性氧簇(ROS)堆积是氧化应激的主要特征,核因子E2相关因子2(Nrf2)是体内重要的抗氧化应激的核转录因子,可在氧化应激状态下激活,通过调节其下游的多种抗氧化基因的表达,发挥抗氧化应激作用,调节肝脏的氧化应激平衡,以阻止肝纤维化的进展[3]。人体内具有复杂的抗氧化应激系统,除Nrf2信号通路外,还原性谷胱甘肽(GSH)作为体内最丰富的非蛋白硫醇,具有抗氧化应激、抗炎、解毒、调节细胞凋亡等作用,在肝脏疾病的发生发展中亦发挥着重要作用[4]。贝那普利是临床上常用的一种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI),可以有效地阻止血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)向血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)转化,安全性好,目前主要应用于心血管系统疾病的治疗,因此本实验拟通过建立CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型,以观察贝那普利对肝纤维化大鼠血清ROS、GSH浓度及肝组织Nrf2表达的影响,探讨其对肝脏的保护作用及可能机制,为肝纤维化治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

清洁级健康雄性SD大鼠购置于河北医科大学实验动物中心;ROS比色法试剂盒购置于上海西唐生物科技有限公司;还原性谷胱甘肽比色法测试盒购置于南京建成生物工程研究院;随机引物、dNTP、反转录酶、RNA酶抑制剂购置于上海生工生物科技有限公司;CCl4购置于天津市风船化学试剂科技有限公司;贝那普利购置于北京诺华制药有限公司。

1.2 动物处理

将22只健康雄性SD大鼠(180-210 g)随机分为3组:对照组6只,模型组8只,治疗组8只。模型组及治疗组均给予皮下注射40%CCl4油剂,1周2次,初始剂量为5 ml/kg,后按2 ml/kg注射,称重1次/周,据体重的变化调整CCl4的剂量,对照组予以同剂量油剂腹部皮下注射;治疗组自实验第1天起即给予贝那普利(10 mg/kg)灌胃,余两组均予以同剂量生理盐水,直至实验结束。在造模及治疗过程中,模型组及治疗组均有2只大鼠死亡。三组大鼠均给予正常饮食,于第8周末分别处死对照组、模型组、治疗组大鼠6只,留取血清及肝组织备用。

1.3 比色法测定血清ROS及GSH的浓度

按照ROS的比色法试剂盒说明书测出吸光值,根据标本吸光值应用计算机软件计算出相应的ROS浓度。根据GSH试剂盒说明书配制标准品溶液,测出标准OD值、空白OD值及标本血清OD值,再进一步计算出血清中GSH的浓度。

1.4 real-time PCR检测肝组织Nrf2 mRNA的表达量

①提取总RNA:采用Trizol试剂一步法抽取肝组织中总RNA;②测定RNA纯度:采用微量分光光度计检测RNA样品纯度;③逆转录合成cDNA:按照Fermentas K1622反应体系进行逆转录;④采用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10 μl反应体系进行定量测定:荧光定量PCR读取Ct(cycle threshold)值,后根据试剂所提供的公式,求得待测肝组织Nrf2 mRNA的表达量。real-time PCR引物序列见表1。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 贝那普利对血清ROS及GSH浓度的影响

与对照组相比,模型组大鼠血清ROS的浓度升高,差异有统计学意义(P<0.05);血清GSH的浓度有升高趋势,差异无统计学意义(P>0.05,见表2)。给予贝那普利治疗后,治疗组血清ROS的浓度较模型组降低,差异有统计学意义(P<0.05);血清GSH的浓度较模型组有升高趋势,差异亦无统计学意义(P>0.05,见表2)。

表2 贝那普利对肝纤维化大鼠血清ROS及GSH浓度的影响

2.2 贝那普利对肝组织Nrf2 mRNA表达量的影响

与对照组相比,模型组肝组织Nrf2 mRNA的表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05);给予贝那普利治疗后,治疗组肝组织Nrf2 mRNA的表达量较模型组升高,差异有统计学意义(P<0.05,见表3)。

表3 贝那普利对肝纤维化大鼠肝组织Nrf2mRNA表达量的影响

3 讨论

肝纤维化是肝脏疾病早期可逆的、复杂的病理生理阶段,炎症反应、氧化应激、局部RAS的活化等均参与了肝脏疾病的发生发展[1,5]。局部RAS的活化与肝纤维化的发生密切相关,AngⅡ作为RAS经典轴中重要的促纤维化因子,可诱导机体产生ROS、刺激相关细胞(如肝星状细胞、心肌间质纤维母细胞及肾间质纤维母细胞等)活化、增殖,从而导致大量细胞外基质(ECM)的生成,促进器官组织纤维化的发展[6,7]。大量ROS的堆积可使机体处于氧化应激状态,Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号通路作为机体内重要的综合性氧化还原反应体系,在抗氧化应激方面发挥着重要作用;Nrf2是该通路中的重要效应因子,生理状态下,位于细胞质内与Keap1结合处于非活性状态;而在氧化应激状态下,则可与Keap1解离转位进入胞核,激活ARE依赖的基因表达,如血红素加氧酶1(HO-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、醌氧化还原酶1(NQO1)等,发挥抗氧化应激作用,以阻止肝纤维化的进展[8,9]。我们前期实验发现大鼠肝纤维化形成过程中,肝匀浆AngⅡ的浓度、血清ROS的浓度及肝组织Nrf2mRNA的表达量均呈升高趋势,且给予贝那普利治疗后,肝匀浆AngⅡ的浓度降低[10,11]。本实验结果显示,模型组大鼠血清ROS的浓度及肝组织Nrf2 mRNA的表达量较对照组均升高,与前期实验结果一致,表明AngⅡ、ROS、Nrf2均参与了肝纤维化的形成和发展。有研究[12,13]发现AngⅡ不仅可以使肝星状细胞活化、增殖,而且可以诱导细胞产生过量的ROS,同时对Nrf2及HO-1的表达有一定的抑制作用。本实验中通过给予贝那普利(临床上常用的ACEI类药物,可有效地阻止AngⅠ向AngⅡ转化,以拮抗AngⅡ的作用)治疗发现,治疗组大鼠血清ROS的浓度较模型组明显下降,肝组织Nrf2 mRNA的表达量则升高,结合前期实验结果表明,贝那普利确可降低AngⅡ的浓度,并可影响ROS的生成及Nrf2的表达。由此可见,贝那普利可能通过减少AngⅡ的生成,从而减少AngⅡ诱导的ROS的产生、降低AngⅡ对Nrf2表达的抑制作用,增强机体的抗氧化应激能力,减缓肝纤维化的进展,对肝脏起保护作用。

还原性谷胱甘肽(GSH)是一种主要在肝内合成的含γ-酰胺键和巯基的三肽,由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成,具有强大的抗氧化、解毒功能,在肝细胞内储存丰富,既可直接与ROS反应发挥抗氧化作用,还可在谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)等的催化下完成;而且在多种肝脏疾病中,常表现为ROS的过量产生、GSH的减少[4]。董亚芬等[14]通过实验发现,大鼠肝纤维化形成过程中,血清GSH的水平呈升高趋势,但各组间差异无统计学意义,可能与疾病过程中GSH的逐渐枯竭有关。本实验模型组血清GSH的浓度较对照组有升高趋势,但差异亦无统计学意义,与既往实验结果一致,表明GSH在肝纤维化形成的过程中发挥着重要作用,但由于肝细胞破坏严重,GSH内源生成减少、消耗过多,血清GSH浓度升高的趋势较缓,甚至最终可能表现为血清GSH浓度降低。临床上,贲道宏[15]以酒精性肝硬化病人为研究对象,通过给予还原性谷胱甘肽单药治疗和缬沙坦、还原性谷胱甘肽联合治疗,发现联合治疗患者的肝功能及肝纤维化指标,与单药治疗患者相比有显著改善,且用药安全性、患者耐受性及依从性均较好。吕文晴等[16]则以高血压患者为研究对象,发现贝那普利联合氨氯地平治疗的患者GPx水平较单用氨氯地平治疗的患者升高,这一结果表明,贝那普利确可抑制机体氧化应激反应,减轻氧化应激损伤。本实验中,给予贝那普利治疗后,GSH的浓度也有一定升高,但差异仍无统计学意义。由此可见,贝那普利的使用可在一定程度上改善肝细胞损伤、升高血清GSH的水平,增强机体的抗氧化应激能力,从而对肝脏起保护作用,但随着肝纤维化的进展,GSH内源生成减少、消耗增多,血清GSH水平升高较缓,其对肝脏的长期保护作用仍有待研究。

综上所述,RAS的活化在肝纤维化进展中发挥着重要作用,尤其是AngⅡ,而贝那普利则可通过抑制AngⅡ的生成,降低血清ROS水平,增加Nrf2及其下游抗氧化基因的表达,增强机体的抗氧化应激能力,从而减缓肝纤维化的进展,对肝脏起保护作用。除此之外,随着肝纤维化的进展、肝细胞损伤的加重,使得GSH内源性生成减少、消耗过多,血清GSH水平升高较缓,甚至可表现为GSH水平下降,贝那普利对血清GSH的影响也有限。目前,还原性谷胱甘肽已广泛应用于临床,治疗各种肝病效果显著,或可将还原性谷胱甘肽联合ACEI/ARB类药物治疗,作为慢性肝病患者治疗的一种新思路,但其对患者的长期受益仍需探讨。