李晶晶,张文馨,张 倩,刘艳月,谷红丽,万菲菲,王 晶

(1郑州大学第一附属医院感染科,郑州 450001;2郑州大学第一附属医院肝胆外科;*通讯作者,E-mail:jing-jingning@163.com)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,目前乳腺癌己成为全球范围内女性死亡率居第二位的恶性肿瘤,严重威胁人类的健康和生命[1,2]。微小RNA(micro RNA,miRNA)是非编码RNA,主要功能是调节个体生长、发育以及疾病发生发展过程相关基因的表达,大量研究证明其对细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡以及侵袭转移等生物学行为发挥重要作用[3,4]。亦有研究发现是由miRNAs调控的特异性转录后靶基因沉默对肿瘤的增殖与进展起调控作用[4]。近几年来,有研究表明miR-346能够抑制肾细胞癌、乳腺癌、急性淋巴细胞性白血病、肺癌和肝癌等多种肿瘤细胞的增殖[5-9],但其在乳腺癌中的作用及其分子机制尚不清楚。本研究采用Agilent miRNA基因芯片技术对乳腺癌及其对应的癌旁组织中miRNA表达情况进行分析,通过实时荧光定量PCR检测乳腺癌组织中miR-346的表达,分析其对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响。本研究还通过观察给予人乳腺癌细胞(MDA-MB-468)miR-346抑制剂后,miR-346对MDA-MB-468细胞增殖、侵袭转移能力的影响,以及BRMS1的表达,从而探讨miR-346抗乳腺癌的可能机制。

1 材料与方法

1.1 标本及主要材料

1.1.1 组织标本 60例乳腺癌患者癌组织及相对应癌旁组织均取自于2014-2018年在郑州大学第一附属医院手术切取的标本。临床资料在医院病案室查得。患者术前均未接受过放化疗治疗,所收标本均在离体后10 min内迅速取材,分别取癌灶及远端3 cm以上处正常乳腺癌组织。本实验经过郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。所得组织标本均获得患者知情同意。

1.1.2 主要材料 乳腺癌细胞系MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,MDA-MB-468,T47D与正常乳腺细胞MCF-10A均购自中科院上海细胞研究所,胎牛血清(美国Gibco公司),RPMI-1640培养基(美国Gibco公司),Lipofectamine2000(美国Invitrogen公司),miR-346抑制剂(中国上海吉玛),抗体(GAPDH、BRMS1)购于美国CST公司,CCK-8(日本东仁化学),microRNA探针法(美国Applied Biosystems公司),Trizol总RNA抽提纯化试剂(中国大连宝生物生物公司),流式细胞仪(BD FACSCantoⅡ USA),Transwell小室(美国Corning公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因芯片 采用Agilent miRNA基因芯片对乳腺癌组织及其相应癌旁正常组织中miRNA进行检测,由倍数变化值(fold change,FC)和t检验获得差异表达miRNA,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值FC≥3.0且P<0.05。

1.2.2 细胞培养 将乳腺癌细胞及乳腺正常细胞在37 ℃,5% CO2恒温培养箱中培养,培养基为含有10%胎牛血清的1640培养基。

1.2.3 细胞分组 MDA-MB-468乳腺癌细胞转染miR-NC为对照组;转染miRNA-346抑制剂为miR-346抑制剂组。

1.2.4 细胞转染 通过Lipofectamine2000将miR-346抑制剂转染至乳腺癌细胞系中,作用48 h后消化收集细胞用于进一步分析。

1.2.5 RNA提取 逆转录和实时荧光定量PCR:根据操作说明书,采用Trizol总RNA抽提纯化试剂分离细胞系和组织标本的总RNA。以U6为内参将miR-346特异性引物经过反转录之后通过microRNA探针法检测miR-346的表达水平。

结果处理:假定目的基因与参照基因的扩增效率均接近100%,采用2-ΔΔCt法对目的基因mRNA进行相对表达量的计算:ΔCt对照组=Ct目的基因-Ct内参;ΔCt实验组=Ct目的基因-Ct内参;ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组;比率实验组/对照组=2-ΔΔCt。

1.2.6 细胞增殖实验 细胞以3 000个/100 μl细胞接种到96孔板中,每组设4个重复,通过CCK-8检测细胞生存率。接种细胞72 h后,每孔加入10 μl CCK-8试剂,置于培养箱中继续孵育2 h。酶标仪450 nm波长处测定吸光度,每组设5个复孔。

1.2.7 细胞凋亡检测 用不含EDTA的胰酶消化6孔板中细胞,通过Annexin Ⅴ和PI染色。染色后的细胞悬液避光常温孵育30 min后通过FACScan流式细胞仪进行分析。每组设3个重复。

1.2.8 迁移和侵袭实验 将基底膜基质原液置于4 ℃冰箱过夜融化后和预冷的无血清1640培养基按照1 ∶3的比例配制侵袭小室上室凝胶液,每孔50 μl包被侵袭小室上室,放置37 ℃孵育箱孵育2 h使其成胶。侵袭小室上室每孔接种200 μl不含血清细胞悬液,下室加入含10%胎牛血清的1640培养基500 μl。将侵袭小室板置于培养箱中继续培养24 h后用结晶紫染色。通过显微镜观察被染色细胞,并进行计数。实验均重复3次。

1.2.9 生物信息学软件预测 利用生物信息学软件microT-CDS和miRecords预测miR-346在乳腺癌细胞系中的靶基因。

1.2.10 Western blot检测BRMS1的表达 提取乳腺癌及其癌旁组织中的总蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白,硝酸纤维素膜转膜,封闭液封闭1 h,一抗4 ℃过夜孵育,二抗室温孵育1 h。凝胶成像观察、拍照。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 乳腺癌组织及其相应癌旁正常组织中miRNA表达情况

结果显示乳腺癌组织和其相对应的癌旁正常组织中有103个差异表达的miRNAs。其中有51个差异表达上调,52个差异表达下调(见图1)。选取在乳腺癌组织中上调差异最明显的miR-346作为研究对象(P<0.05)。

2.2 miR-346在乳腺癌中表达情况

采用real-time PCR检测60例乳腺癌组织和相对应的60例癌旁正常组织中miR-346的表达,结果表明,与癌旁正常组织比较,乳腺癌组织中miR-346的表达显著上调(0.92±0.09vs4.30±0.62,P=0.018,见图2)。

红色代表上调基因,绿色代表下调基因图1 乳腺癌组织及其相应癌旁正常组织中miRNA表达情况Figure 1 The differential miRNA expression between breast cancer tissue and para-carcinoma tissue

与癌旁组织相比,*P<0.05图2 miR-346在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达Figure 2 The expression of miR-346 in breast cancer tissue and para-carcinoma tissue

2.3 miR-346在不同临床分期的乳腺癌组织中的表达

为了探讨miR-346在不同分期的乳腺癌组织中的表达,我们采用Real-time PCR检测不同临床分期乳腺癌组织(Ⅰ期12例,Ⅱ期10例,Ⅲ期14例,Ⅳ期24例)中miR-346的表达。结果表明,从Ⅰ期至Ⅳ期,乳腺癌组织中miR-346的表达逐渐增高,分别为1.67±0.32,2.83±0.34,3.94±0.32,5.93±0.62,与Ⅰ期比较差异均有统计学意义(P<0.01,见图3)。

2.4 miR-346在不同乳腺癌细胞株中的表达

分别检测乳腺癌细胞株MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,MDA-MB-468,T47D与正常乳腺细胞MCF-10A中miR-346水平,检测结果通过2-ΔΔCt法进行相对定量分析。乳腺癌细胞株中miR-346 mRNA水平较MCF-10A的表达均有所上升,且差异有统计学意义(见图4),其中以MDA-MB-468高表达最为显著。

2.5 miR-346低表达对细胞增殖和凋亡的影响

结果显示,miR-346抑制剂组细胞吸光度值明显下降,MDA-MB-468细胞的增殖明显降低(见表1,图5)。凋亡结果显示,miR-346抑制剂组细胞凋亡显著增加,与对照组比较差异有统计学意义(见图5)。

与乳腺癌Ⅰ期相比较,**P<0.01图3 不同临床阶段的乳腺癌组织中miR-346的表达Figure 3 The expression of miR-346 in different stages of breast cancer tissues

与正常乳腺细胞比较,**P<0.01图4 miR-346在乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞中的表达Figure 4 The expression of miR-346 in breast cancer cells and normal breast epithelial cells

2.6 miR-346对细胞迁移和侵袭能力的影响

结果表明,与对照组相比,miR-346抑制剂组侵袭能力和迁移能力显著降低(见图6)。

表1 miR-346对MDA-MB-468细胞增殖的影响

图5 miR-346对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响Figure 5 Effect of miR-346 on the proliferation and apoptosis of breast cancer MDA-MB-468 cells

与对照组相比,**P<0.01图6 miR-346对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响Figure 6 Effect of miR-346 on invasiveness and migration of breast cancer MDA-MB-468

2.7 BRMS1基因3′非翻译区与miR-346配对序列

利用生物信息学软件microT-DCS和miRecords预测,miR-346的靶基因可能是BRMS1,miR-346种子区存在与BRMS1基因3′非翻译区互补配对的序列(见图7)。

图7 miR-346与BRMS1 3′互补配对序列Figure7 Binding sequence of miR-346 and BRMS1 3′UTR

2.8 BRMS1在乳腺癌组织中的表达

在乳腺癌组织中BRMS1 mRNA相对表达量显著低于癌旁正常组织,差异有统计学意义(0.33±0.045vs1.04±0.160,P=0.0017,见图8)。Western blot检测60例乳腺癌组织与癌旁正常组织中BRMS1蛋白表达情况,结果显示乳腺癌组织中BRMS1蛋白的表达水平低于癌旁正常组织中表达水平(见图8)。

2.9 miR-346下调BRMS1的表达

结果表明,转染miR-346抑制剂后BRMS1mRNA表达显著增加(见图9)。通过相关性分析对数据进行进一步分析,结果显示miR-346与BRMS1 mRNA的表达水平呈负相关(r=-0.82,P<0.01,见图9)。

图8 BRMS1在乳腺癌及其癌旁组织中的表达Figure 8 The expression of BRMS1in breast cancer tissues and para-carcinoma tissue

图9 miRNA-346对乳腺癌细胞中BRMS1表达的影响Figure 9 The effect of miR-346 on BRMS1 mRNA in breast cancer cell

3 讨论

大量研究证明miRNA在肿瘤的发生、发展过程中起关键作用,并且对许多重要的生理过程都起到关键性调控作用[10-13]。目前已发现有超过50%的人类microRNA基因分布在肿瘤相关基因组区域或脆性位点[14]。有研究表明,miR-346在肝癌、膀胱癌、肺癌等恶性肿瘤中显著上调[15]。本研究通过对乳腺癌组织及其相对应的癌旁组织进行基因芯片检测发现,与癌旁组织相比,乳腺癌组织中的miR-346的表达显著上调,通过实时荧光定量PCR检测乳腺癌组织及其相对应的癌旁组织中miR-346的表达,发现乳腺癌中miR-346表达显著升高。为了进一步探讨miR-346在乳腺癌细胞中的功能,本研究通过脂质体转染法将miR-346抑制剂转染乳腺癌细胞,成功下调miR-346的表达。而且,miR-346抑制剂显著抑制MDA-MB-468细胞的增殖,促进细胞凋亡。为进一步阐明miR-346下调对乳腺癌转移的影响,我们将miR-346抑制剂组与对照组中细胞侵袭和转移的细胞数进行比较,发现miR-346抑制剂组的侵袭细胞数和转移细胞数均低于对照组,且差异有统计学意义。提示miR-346可能与乳腺癌肿瘤的发生以及进展相关联。

利用生物信息学软件microT-DCS和miRecords预测,miR-346的靶基因可能是BRMS1,miR-346种子区存在于BRMS1基因3′非翻译区互补配对的序列。乳腺癌转移抑制基因(BRMS1)是最先在乳腺癌中发现的具有抑制乳腺癌代谢、减少肿瘤细胞转移的基因[16]。BRMS1目前作为诊断多种肿瘤预后情况的基因之一。有研究报道,在鼻咽癌中,BRMS1高表达可以有效抑制肿瘤的转移[17]。骨肉瘤患者肿瘤细胞中BRMS1低表达其预后较差,且具有高转移性[18]。在本研究中发现,miRNA-346的低表达能显著上调乳腺癌细胞中BRMS1的表达,且二者在乳腺癌组织中的表达具有显著的负相关关系。这些结果表明,miR-346和BRMS1基因对细胞增殖和转移发挥相反的功能,提示BRMS1可能成为乳腺癌细胞中miR-346的功能性靶基因。因而,BRMS1可能是乳腺癌的一个潜在的分子靶点。

总之,本研究证实与癌旁组织相比,miR-346在乳腺癌组织中的表达普遍上调,而且其表达水平升高的程度与乳腺癌的预后有关,其升高程度越高,预后越差。BRMS1是miR-346调控的下游靶基因,且miR-346对BRMS1起负调节作用。BRMS1是一个肿瘤抑制基因,在乳腺癌中,可以通过调节miR-346以及靶基因BRMS1来阻止细胞的增殖和浸润,为肿瘤的基因治疗提供了新视角。