陈 梅,郑鹏生

(西安交通大学第一附属医院生殖医学科,西安 710061;*通讯作者,E-mail:zpsheng@mail.xjtu.edu.cn)

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一,严重威胁妇女生殖健康,其发病率和致死率在全球女性恶性肿瘤中位居第四。全世界每年新发病例约有50万,其中80%分布在发展中国家,而我国作为发展中国家,每年宫颈癌新增病例高达13万,约占全球的1/3。尤其是近年来,宫颈癌发病出现年轻化的趋势,这不得不引起人们足够的重视。虽然HPV感染与宫颈癌发生的关系已被许多研究证实,但是HPV感染者最终只有极少数发展至浸润性宫颈癌,这表明单纯HPV感染并不能促成宫颈癌的发生,宫颈的发生是多因素长期相互作用的结果[1]。近年来,越来越多的研究表明一些基因的异常表达在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。

干细胞相关基因SALL4是人类婆罗双树样基因(SALL)家族成员之一,与果蝇婆罗双树基因Spalt为同源基因,包括SALL4A和SALL4B两个亚型[2]。目前认为SALL4基因在维持胚胎干细胞功能中起重要作用,能够维持胚胎干细胞的自我更新和多潜能性[3]。近年来发现,SALL4可作为一种原癌基因,它在人类多种实体肿瘤中均呈高表达,如:肝癌[4]、胃癌[5]、结/直肠癌[6]、乳腺癌[7]、子宫内膜癌[8]等,并参与肿瘤的发生、发展、侵袭及耐药。有研究显示,SALL4在宫颈癌组织中的表达明显升高[9],但SALL4在宫颈癌细胞中的作用及作用机制尚不清楚。本研究通过构建稳定过表达SALL4B的SiHa细胞株,研究SALL4B对SiHa细胞增殖及凋亡的影响,并初步探讨其可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司;Anti-SALL4鼠抗人单克隆抗体、Anti-GAPDH鼠抗人单克隆抗体及Anti-β-catenin鼠抗人单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司;羊抗鼠IgG-HRP购自中国武汉博士德生物工程有限公司;蛋白定量试剂盒购自德国Merck公司;ECL发光液购自美国Millipore公司;pCAG-IRES2-AcGFP-neo真核质粒由西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室长期保存;脂质体Lipofectamine 2000购自美国Life公司;CCK-8试剂盒购自中国上海酶联生物科技有限公司;细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒均购自美国BD公司;CO2培养箱购自德国Heraeus公司;FACS Calibur cytometer流式细胞仪购自美国BD公司;全自动化学发光成像分析系统购自中国上海天能科技有限公司。

1.2 细胞培养

SiHa细胞系购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection,ATCC),并由西安交通大学环境与疾病相关基因教育部重点实验室保存,应用含10%胎牛血清、1 000 μg/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的DMEM高糖培养基,置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养。当细胞融合度达80%,并处于对数生长期时,用0.25%胰酶消化液消化细胞,收集细胞备用。

1.3 载体构建及细胞转染

通过Premier5.0软件设计所获得的的SALL4B引物(正向引物:CCGGAATTCGCCACCATGTCGAGGCGCAAGCAGGCGAAAC;反向引物:CGCGGATCCTTAGCTGACCGCAATCTTGTTTTCTTCC),以SiHa细胞系为模板,通过PCR获得SALL4B全长的cDNA片段,应用EcoRⅠ及BamHⅠ限制性内切酶将PCR扩增的SALL4B目的片段产物和真核质粒pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo分别进行双酶切,将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳胶回收纯化后通过使用DNA连接酶将空载体和SALL4目的片段进行连接,转化感受态,筛选阳性克隆,提取质粒后进行酶切鉴定,将双酶切鉴定的阳性克隆送基因公司进行测序,挑选测序结果与基因库中的SALL4B基因序列完全一致的克隆进行细胞转染。通过脂质体2000,分别将空质粒pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo和重组质粒pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo-SALL4B转染至SiHa细胞中,使用G418(1 000 mg/ml)筛选单克隆细胞,通过Western blot试验鉴定稳定表达SALL4B的阳性细胞克隆。

1.4 细胞计数和CCK8实验

将处于对数生长期的各组SiHa细胞胰酶消化后制备成单细胞悬液,将细胞按照3×104/孔的浓度接种于6孔板,每孔加入2 ml细胞培养基,置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养;于接种后第1,3,5,7天,应用计数板于倒置显微镜下计数细胞,并绘制细胞生长曲线。每个细胞株设置3个复孔,实验重复3次。将处于对数生长期的各组SiHa细胞制备成密度为1×105/ml的细胞悬液,在96孔板中每孔接种100 μl细胞悬液,置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养,于接种后24,36,48,72 h,每孔加入10 μl CCK-8溶液,继续培养3 h,酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。各实验组均设置3个复孔,实验重复3次。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡

常规消化处于对数生长期的各组细胞,用预冷的PBS洗涤细胞2次,1 000 r/min离心5 min,弃掉PBS,再加入预冷的70%乙醇于4 ℃固定细胞12 h。PBS洗涤细胞2次,将PI染液(含有0.01% RNase)100 μl加入细胞中,充分混匀,4 ℃避光孵育30 min,上机检测,通过CellQuest软件分析结果。实验至少重复3次。常规消化处于对数生长期的各组细胞,用预冷的PBS洗涤细胞2次,加入Annexin Ⅴ和7-AAD避光孵育10 min,上机检测,通过CellQuest软件分析结果。实验至少重复3次。

1.6 Western blot检测SALL4B和β-catenin的表达

利用细胞裂解液充分裂解各组细胞,收集裂解液,BCA法定量蛋白。上样50 μg蛋白,SDS-PAGE分离蛋白,湿转法转至PVDF膜,常温下应用脱脂奶常规封闭1 h,加一抗(抗-SALL4 1 ∶500;抗-β-catenin 1 ∶1 000;抗-GAPDH 1 ∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜,10 min×4次,加入相对应的HRP-IgG二抗(1 ∶10 000稀释),室温孵育1 h,TBST洗膜,10 min×4次。在PVDF膜上加ECL发光液,应用全自动化学发光成像分析系统进行成像分析,采用ImageJ2X软件进行半定量灰度分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 成功构建外源性过表达SALL4B的SiHa细胞株

通过脂质体2000,分别将空质粒pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo和重组质粒pCAG-IRES2-AcGFP1-Neo-SALL4B转染至SiHa细胞中,使用G418(1 000 mg/ml)筛选单克隆细胞,通过Western blot实验鉴定稳定表达SALL4B蛋白的阳性细胞克隆(见图1A),从而筛选出稳定过表达SALL4B的SiHa细胞株(SiHa-SALL4B)。免疫细胞化学染色法亦显示SiHa-SALL4B细胞中SALL4B的表达明显高于对照组细胞(SiHa-GFP)(见图1B)。

2.2 外源性过表达SALL4B对SiHa细胞增殖能力的影响

应用细胞计数法检测各组细胞的增殖速度,并绘制细胞生长曲线,与对照组细胞相比,SiHa-SALL4B组细胞的增殖速度明显加快(P<0.01,见图2A)。通过CCK-8实验检测了SALL4B对SiHa细胞增殖活力的影响,结果显示,SiHa-SALL4B组细胞的吸光度显著高于对照组细胞的吸光度(P<0.05,见图2B)。细胞计数和CCK-8实验均显示,过表达SALL4B后SiHa细胞的增殖能力和细胞活力明显增强,表明SALL4B可以促进宫颈癌细胞的体外增殖能力。

A.SALL4B过表达后SiHa细胞的生长曲线 B.CCK-8实验测定SALL4B过表达后SiHa细胞的活力与SiHa-GFP组比较,*P<0.05,**P<0.01图2 外源性过表达SALL4B对宫颈癌细胞SiHa增殖能力的影响Figure 2 Effect of exogenous SALL4B-overexpression on the proliferative ability of SiHa cells

2.3 外源性过表达SALL4B对SiHa细胞细胞周期进程的影响

应用流式细胞仪分析SiHa-SALL4B组和SiHa-GFP组细胞周期的变化。结果显示,在SiHa-SALL4B细胞中处于G0/G1的细胞百分比为59.13%±3.59%,明显低于SiHa-GFP细胞中的65.31%±2.88%(P<0.05,见图3),在SiHa-SALL4B细胞中处于S期的细胞百分比为31.15%±5.78%,明显高于SiHa-GFP细胞中的23.07%±4.96%(P<0.01,见图3),表明在SiHa细胞中外源性过表达SALL4B可以促进细胞周期从G0/G1期向S期的转换。

图3 外源性过表达SALL4B宫颈癌细胞SiHa细胞周期的检测Figure 3 The cell cycle in exogenous SALL4B-overexpressed SiHa cells

2.4 外源性过表达SALL4B对SiHa细胞凋亡的影响

应用流式细胞仪分析SiHa-SALL4B组和SiHa-GFP组细胞凋亡的变化。结果显示,SiHa-SALL4B组凋亡细胞的比例为8.06%±1.37%,显著低于SiHa-GFP组的13.77%±1.72%(P<0.01,见图4)。表明在SiHa细胞中外源性过表达SALL4B可以抑制细胞凋亡。

2.5 外源性过表达SALL4B对SiHa细胞β-catenin表达的影响

应用Western blot分别检测SiHa-SALL4B和SiHa-GFP细胞全细胞溶解液和核溶解液中β-catenin的表达情况。结果显示,与对照细胞比较,SiHa-SALL4B细胞全细胞溶解液中β-catenin的表达水平显著上调,差异具有统计学意义(P<0.01,见图5A),并且核溶解液中β-catenin的表达水平也明显升高(见图5B)。免疫细胞化学染色法结果显示,SALL4B过表达可以促进β-catenin的入核,β-catenin的核堆积增多(见图5C)。表明在SiHa细胞中外源性过表达SALL4B不仅能上调β-catenin表达,而且可以促进β-catenin的入核,从而发挥对下游靶基因的转录调节作用,促进SiHa细胞的增殖。

图4 外源性过表达SALL4B宫颈癌细胞SiHa细胞凋亡的检测Figure 4 The cell apoptosis in exogenous SALL4B-overexpressed SiHa cells

图5 外源性过表达SALL4B宫颈癌细胞SiHa中β-catenin表达的检测Figure 5 The expression level of β-catenin in exogenous SALL4B-overexpressed SiHa cells

3 讨论

肿瘤发生是一个极其复杂的过程,往往是多因素相互作用的结果,其中与基因的改变密不可分,癌基因和抑癌基因的正常表达和相互协调维持着细胞的正常生长,一旦它们表达异常或者调节网络失衡就会导致细胞异常增殖和分化,最终引起癌症的发生。研究已经发现SALL4B在多种实体肿瘤中呈高表达,外源性过表达SALL4B在体外能促进子宫内膜癌、肝癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞的增殖。目前宫颈癌的发病机制仍不清楚,虽然许多研究表明高危型HPV感染是导致宫颈癌发病的重要原因,但是随着分子生物学研究的不断深入,人们发现虽然HPV持续感染是宫颈癌发病必不可少的条件,但最终只有少数HPV感染者发展至宫颈癌。另外,性生活紊乱、早婚、早育、多产、免疫力降低等也能增加宫颈癌发病的风险。近年来,研究者发现宫颈癌的发生与P53、LGR5、SOX9等基因的异常表达有关。本研究结果显示外源性过表达SALL4B能促进SiHa细胞的增殖,并且细胞增殖能力的提高与细胞周期和细胞凋亡有关,SALL4B可能通过促进SiHa细胞的细胞周期进程和抑制细胞凋亡来促进SiHa细胞的增殖能力。

Wnt/β-catenin信号通路参与多种人类肿瘤的发生和发展,它在调控细胞多能性和细胞恶变中发挥重要作用,与肿瘤细胞的增殖、凋亡、转移等生物学特性密切相关,在多种恶性肿瘤中β-catenin出现异常表达或基因突变[10,11]。研究已发现SALL4与Wnt/β-catenin信号通路存在关联,在急性粒细胞白血病中SALL4呈高表达,并通过Wnt/β-catenin信号通路来促进急性粒细胞白血病的发生和发展,SALL4与Wnt/β-catenin信号通路的对话机制可能是通过SALL4蛋白与β-catenin蛋白相互作用来介导的[12]。在食道鳞状细胞癌TE7和EC109细胞中,SALL4在维持癌细胞干细胞样特性及上皮-间充质转化中发挥重要作用,而这些作用的发挥与Wnt/β-catenin信号通路密切相关[11]。本研究实验结果表明外源性过表达SALL4B不仅能上调SiHa细胞中β-catenin的表达水平,还能促进β-catenin的入核,从而发挥对下游靶基因的转录调节作用。推测SALL4B基因在SiHa细胞增殖和凋亡中的作用可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

综上所述,外源性过表达SALL4B可以加速细胞周期从G0/G1期向S期转换并抑制细胞凋亡,从而促进SiHa细胞的增殖能力,其可能分子机制与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。但是,在宫颈癌细胞中有关SALL4B与Wnt/β-catenin信号通路的具体关联机制有待进一步深入研究。