张金微，孟 玥，侯铁英△

1.南方医科大学第二临床医学院，广东广州 510515；2.广东省人民医院/广东省医学科学院检验科，广东广州 510080

溶酶体四次跨膜蛋白B(LAPTM4B)基因是刘军建等[1]首次发现的一条在大多数肝癌细胞中高表达，而在正常肝细胞中低表达的新基因。该基因已被证实在多种肿瘤中高表达[2-6]。与此同时，LAPTM4B*2型等位基因已被证实与多种肿瘤的易感性相关[7]，同时研究发现在直肠癌、肝癌、胃癌等癌症中的LAPTM4B*2型等位基因高表达与肿瘤的淋巴结转移呈正相关，与肿瘤组织分化程度呈负相关[8-10]。但是，LAPTM4B基因多态性在乳腺癌中的表达及其临床病理意义尚无明确定论。本研究拟对LAPTM4B基因多态性与乳腺癌易感性、临床病理特征的相关性进行分析，初步探索LAPTM4B基因在乳腺癌中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2010—2019年就诊于广东省人民医院的乳腺癌患者424例为病例组，年龄24～73岁，所有病例均经病理学证实为原发性乳腺癌。选取同期该院体检健康者238例为对照组，年龄21～78岁，两组年龄比较差异无统计学意义(P=0.098)，具有可比性。收集所有病例组患者的临床病例资料，包括年龄、原发肿瘤大小、腋窝淋巴结状态、病理学类型、病理学分级、雌激素受体(ER)状态、孕激素受体(PR)状态、激素受体(HR)状态、人类表皮生长因子受体2(HER2)状态、Ki-67指数等。根据肿瘤细胞的ER、PR、HER2状态及Ki-67指数进行分子分型分类：Luminal A型(ER、PR阳性，HER2阴性，Ki-67≤14)，Luminal B 型+HER2阴性[ER和(或)PR阳性，HER2阴性，Ki-67>14]，Luminal B型+HER2 阳性(ER阳性，PR阳性或阴性，HER2阳性)，HER2阳性型(HR、ER、PR阴性，HER2阳性)，三阴型(ER、PR、HER2均阴性)。

1.2仪器与试剂 DNA提取试剂盒购自北京天根公司；Allegra 64R高速台式离心机购自美国贝克曼库尔特公司；ABI 9700 PCR扩增仪购自美国赛比奥公司；Sub-cell大型电泳仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1基因组DNA提取 取所有研究对象外周血10 mL，以乙二胺四乙酸二钾抗凝处理，严格按照外周血DNA提取试剂盒说明书提取纯化基因组DNA，-20 ℃下保存备用。

1.3.2PCR扩增 采用DNA提取试剂盒对提取纯化的基因组DNA进行PCR扩增。LAPTM4B引物，上游：5′-GCC GAC TAG GGG ACT GGC GGA-3′，下游：5′-CGA GAG CTC CGA GCT TCT GCC-3′。内参β-actin引物，上游：5′-TCA CCA ACT GGG ACG ACA T-3′，下游：5′-AGG TAG TCA GTC AGG TCC CG-3′。反应条件:94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增33个循环;最后于72 ℃，延长反应 5 min。

1.3.3琼脂糖凝胶电泳 将PCR产物加样在2.5%琼脂糖凝胶中，100 V，40 min电泳鉴定。LAPTM4B*1/1型可扩增出1条204 bp片段，LAPTM4B*1/2型可分别扩增出1条204 bp片段和1条223 bp片段，LAPTM4B*2/2型可扩增出1条223 bp片段，β-actin可扩增出1条340 bp片段。

1.4统计学处理 应用SPSS25.0统计软件对数据进行处理分析。通过χ2检验判断病例组与对照组的等位基因是否符合Hardy-weinberg平衡；采用比值比(OR)和95%置信区间(CI)评估相关因素对乳腺癌危险度的影响；χ2检验分析LAPTM4B基因多态性与乳腺癌临床病理特征的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1数据符合Hardy-weinberg平衡 用病例组与对照组各基因型表达的实际频率与期待频率做χ2检验，验证病例组(P=0.104)和对照组(P=0.165)差异无统计学意义，所用数据可以代表各自人群。

2.2LAPTM4B基因多态性的分布情况 研究纳入的424例乳腺癌患者中，LAPTM4B*1/1型、LAPTM4B*1/2型、LAPTM4B*2/2型分布频率分别为36.3%(154/424)、44.8%(190/424)、18.9%(80/424)。与LAPTM4B 1型(*1/1型)比较，LAPTM4B 2型(*1/2型+*2/2型)在乳腺癌患者中的分布频率更高(占63.7%)。见表1。

2.3LAPTM4B基因多态性与乳腺癌易感性的关系 病例组中LAPTM4B*2型等位基因的分布频率较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05)；基因型分布在两组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；*1/2型和*2/2型基因携带者患乳腺癌的危险性分别是*1/1型的1.488倍(95%CI1.061～2.085，P=0.021)与4.915倍(95%CI2.612～9.249，P<0.05)。*2型等位基因携带者患乳腺癌的危险性是*1型等位基因的1.911倍(95%CI1.496～2.440，P<0.05)。见表1。

2.4LAPTM4B基因多态性与乳腺癌临床病理特征的相关性 LAPTM4B基因多态性与乳腺癌患者肿瘤大小、病理学分级、淋巴结状态及ki-67的表达情况有相关性(P<0.05)；与肿瘤位置、有无远处转移、分子分型均无相关性(P>0.05)，见表2。

表1 两组基因型及等位基因分布情况[n(%)]

表2 LAPTM4B基因多态性与乳腺癌临床病理特征的相关性[n(%)]

3 讨 论

乳腺癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤，发病率位居我国女性恶性肿瘤的首位，病死率位居我国女性恶性肿瘤的第二位[11]。常规的乳腺癌的治疗方法包括手术、放疗和化疗这3种方式单独或者联合使用[12]。近年来，乳腺癌的靶向治疗越来越受到临床重视[13]。尽管乳腺癌诊疗水平不断取得进步，乳腺癌的病死率已经有所降低，但乳腺癌的诊断和治疗仍旧是一大难题[14-15]。乳腺癌的发生、发展涉及基因突变、积聚的多个阶段，导致肿瘤异常的增殖、侵袭、转移、复发。因此，发现和研究新的乳腺癌相关基因，寻找新的诊断及治疗靶点，是一项十分迫切且有重要现实意义的工作。

LAPTM4B基因位于染色体8q22.1，长度约50 kb，其由7个外显子及6个内显子组成，包含1个951核苷酸的开放阅读框[16]。LAPTM4B可编码2种不同的蛋白：LAPTM4B-35和LAPTM4B-24。LAPTM4B-35蛋白被证实与多种肿瘤的发生、发展有关，在肺癌和肝癌等肿瘤中高表达，LAPTM4B-35基因的表达水平与淋巴结的转移率呈正相关，与肿瘤的分化程度呈负相关[17-18]。

此外，已发现LAPTM4B基因有2种等位基因LAPTM4B*1型及LAPTM4B*2型，二者唯一的区别在于LAPTM4B*2型第1外显子5′端非翻译区处存在2个串联重复的19 bp序列，而LAPTM4B*1型该区仅有1个该19 bp序列[19]。2种等位基因构成的基因型有LAPTM4B*1/1，LAPTM4B*1/2，LAPTM4B*2/2 3种。由于有2种等位基因的存在，LAPTM4B基因呈现多态性。

MENG等[20]研究表明，子宫内膜癌人群LAPTM4B*2型基因分布频率高于健康人群，*1/2型和*2/2型相对于*1/1基因型个体患子宫内膜癌的风险更高(OR值分别为1.572和2.335)。此外，WANG等[21]的研究结果也表明肝癌人群*1/2和*2/2基因型频率高于健康人群(OR值分别为1.898和2.483)。这提示LAPTM4B基因与子宫内膜癌及肝癌的易感性相关。但是上述研究尚未发现LAPTM4B基因多态性与该肿瘤临床病理特征的明显相关性，原因可能与LAPTM4B基因在不同肿瘤之间的作用机制存在差异性，以及上述研究病例数不足有关。本研究发现，病例组中*2型等位基因的分布频率为41.3%，高于对照组的26.9%，携带*2型等位基因相对于*1型等位基因可使个体患乳腺癌的危险性增加1.911倍(95%CI1.496～2.440，P<0.05)。其中病例组*1/2基因型和*2/2基因型携带者患乳腺癌的危险性分别是*1/1基因型的1.488倍(95%CI1.061～2.085，P=0.021)与4.915倍(95%CI2.612～9.249，P<0.05)。这些结果均提示*2等位基因也与乳腺癌的易感性有关。LAPTM4B*1型及LAPTM4B*2型2个等位基因唯一区别在于非编码区的19 bp序列不同。因此，不同等位基因对肿瘤不同的易感性很大可能归结于19 bp基因序列的数目不同。既往研究提示，LAPTM4B*2型等位基因多出的19 bp序列，一方面可能因存在更多转录因子结合位点，促使相关基因更多结合于LAPTM4B*2启动子区，促进LAPTM4B基因上调，以及乳腺癌的发生、发展；另一方面LAPTM4B*2型等位基因也有可能由于19 bp序列的插入，导致mRNA翻译起始密码子前移，产生新的促肿瘤发生的蛋白[22-23]。

LAPTM4B基因已被报道有促进肿瘤细胞增殖、侵袭，启动自噬，抑制肿瘤细胞凋亡，协助耐药性产生的作用[24]。在小鼠体内，敲低LAPTM4B基因可明显阻断骨肉瘤细胞的增殖和侵袭，抑制肿瘤的生长和转移，为LAPTM4B基因作为骨肉瘤治疗的新靶点提供可能[25]。一项Meta分析显示，LAPTM4B*2型等位基因的携带者较LAPTM4B*1 型等位基因携带者其罹患肿瘤的风险更高，且LAPTM4B*2 型等位基因被证实为肿瘤的风险因子之一[26]。LAPTM4B 2型(*1/2型+*2/2型)与肿瘤分期显著相关[27]。本研究针对424例经病理确诊为乳腺癌的患者进行了LAPTM4B等位基因分型。研究结果显示，LAPTM4B*1/1型、LAPTM4B*1/2型、LAPTM4B*2/2型分布频率分别为36.3%(154/424)、44.8%(190/424)、18.9%(80/424)。与LAPTM4B 1型(*1/1型)比较，LAPTM4B 2型(*1/2型+*2/2型)在乳腺癌患者的分布频率更高(占63.7%)。同时，本研究进一步观察了LAPTM4B基因多态性与乳腺癌患者各临床病理特征的相关性，结果表明LAPTM4B基因多态性与乳腺癌患者肿瘤大小、病理学分级、淋巴结状态及ki-67表达情况有相关性(P<0.05)。与肿瘤位置、有无远处转移、分子分型均无相关性(P>0.05)。提示 LAPTM4B基因可能与乳腺癌恶性程度及侵袭能力相关。本研究结果表明，LAPTM4B*2/2型乳腺癌患者的肿瘤最大径>2 cm、病理学分级Ⅲ级、淋巴结阳性、ki-67≥30%所占比例明显高于LAPTM4B*1/1 型、LAPTM4B*1/2 型，提示与其他2种基因型比较，LAPTM4B*2/2型乳腺癌患者肿瘤的恶性程度更高、侵袭能力更强。但由于本研究缺乏患者治疗随访情况，给预后评估带来一定困难，无法进行3种基因型间的预后比较。此外有研究发现，相对于乳腺癌其他分子分型，LAPTM4B在三阴型乳腺癌中表达最高[28]。本研究尚未发现LAPTM4B基因多态性与乳腺癌分子分型的相关性。当然，可能与中国乳腺癌以Luminal A型为主，三阴型乳腺癌病例数较少有关。笔者认为研究样本数量还有待增加，以满足更多分层因素中数据的量化，来进一步阐明临床资料的相关性。

综上所述，本研究证实了LAPTM4B*2型等位基因与乳腺癌易感性相关，因此，LAPTM4B*2型等位基因可作为筛查乳腺癌易感人群和高危人群的指标，有较大的应用价值。此外，携带LAPTM4B*2型等位基因乳腺癌患者其肿瘤可能有更高的生长、侵袭、浸润能力，提示LAPTM4B 可能会成为乳腺癌筛查及治疗的潜在靶点，可间接为乳腺癌患者临床治疗方案的选择及预后评估提供参考依据。