伊立超，娄安钢

猪流行性腹泻病毒（PEDV）核酸疫苗研究进展

伊立超，娄安钢*

（延边大学农学院，吉林 延吉 133000）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是危害养猪业健康发展的重要疾病之一。它是急性的，具有高度传染性，给养猪业造成严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）感染会破坏动物的消化系统，导致患猪食欲不振，呕吐和严重腹泻，用药物治愈的仔猪也会受到生长不良等因素的严重影响。与传统的PEDV灭活疫苗和PEDV减毒疫苗相比，PEDV核酸疫苗具有安全性好，制备简单，免疫效果好的优点。文章着重对PEDV发病机理和PEDV核酸疫苗的研究进展展开综述，从而加深对PEDV和PEDV核酸疫苗的了解，以期为PEDV感染的预防和控制措施提供参考。

猪流行性腹泻病毒；发病机制；核酸疫苗

猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的急性传染病。该病的主要特征是仔猪急性水泻，脱水，呕吐和高死亡率[1-3]，任何阶段的猪对PEDV均易感，但由于新生仔猪消化系统和免疫系统发育不完善，母源抗体不足以保护它们免受PEDV感染。被PEDV感染的仔猪的平均死亡率可高达80 %。断奶的猪和育肥的猪连续腹泻5～7 d后即可自愈。成年猪通常只出现呕吐和厌食症，没有其他明显的临床症状[4-5]。1971年，PED首次在英国发生。然后它传播到其他欧洲国家，给许多国家的养猪业造成严重的经济损失。1978年，在比利时分离到了类似于冠状病毒的病原体CV777，病原性测试证实分离出的病毒是PED的病原体[6]。1982年，PED首次在亚洲报道。与当时的欧洲相比，PED在亚洲的流行更为严重[7]。特别是自2010年以来，随着PEDV新变种的出现，中国，韩国，日本和其他亚洲国家发生了严重的PED暴发[8-10]，哺乳仔猪的致死率可高达100 %，PED对亚洲养猪业产生了越来越大的影响。

疫苗免疫是预防和控制PED的最重要手段。目前，市场上的商业疫苗主要是PEDV灭活疫苗和PEDV减毒疫苗。这些疫苗对相同类型的野生株具有良好的免疫效果，但是PED能够在世界范围内流行并给农民造成巨大经济损失的原因恰恰是因为PEDV株具有多种基因型并且容易发生基因突变，使菌株的毒力得到增强，因此现有疫苗很难发挥保护作用。

随着基因工程技术和分子生物学技术的发展，人们开始将注意力转向新的基因工程疫苗，例如亚单位疫苗，活载体疫苗和核酸疫苗。因此，本文总结了PEDV的分子生物学和发病机理，以及PEDV核酸疫苗获得的最新研究成果，为预防和控制PED提供理论指导。

1 PEDV概述

1.1 PEDV基因组和遗传结构

PEDV属于尼多病毒目，冠状病毒属和α-冠状病毒亚科。病毒颗粒是多球形的，直径约90～ 190 nm，具有电子致密的核和中心晕圈，并且从核辐射出约20 nm的棒状突起。PEDV的基因组是线性单链正链RNA，大小约为28 kb。整个PEDV基因组包括5'帽子结构（Cap）和3'poly（A）尾部结构。两端的非编码区（UTR）包含至少7个开放阅读框（ORFla，ORF1b，ORF2～6）[11-12]。位于5'近端的ORF1a和ORF1b占据了基因组的2/3，该基因组也不编码结构蛋白（nsp），其分别编码病毒聚合酶1a和1b，并且在PEDV的繁殖和复制中起着非常重要的作用。ORF3基因编码一种辅助蛋白，其与病毒的致病性有关[13]。3'末端附近的ORF2，ORF4，ORF5和ORF6基因编码四种结构蛋白：151.68 kDa的纤突糖蛋白（S），8.79 kDa的包膜蛋白（E），25.37 kDa的基质蛋白（M）和48.93 kDa的核蛋白（N）[14]。

1.2 PEDV发病机制

PEDV具有强烈的宿主细胞倾向，通常仅在小肠绒毛顶部的肠道上皮细胞中感染和复制，导致绒毛萎缩和吸收不良性腹泻，继而出现电解质失衡，代谢性酸中毒甚至死亡[15-17]。

大量研究发现，猪氨肽酶N（pAPN）是PEDV的功能性受体，在PEDV侵袭宿主细胞的过程中起着非常重要的作用[18-19]。研究表明，PEDV S蛋白中S1域的N端区域可以识别并结合到pAPN，然后通过直接膜融合将PEDV内化到靶细胞中，然后通过病毒去核将病毒基因组释放到细胞质中并开始基因组复制[20]。Xu等[21-22]研究发现，PEDV能诱导内质网应激和激活NF-B通路，并能促进宿主细胞IL-8的表达，引起细胞炎症反应，导致宿主细胞的死亡和破碎并释放出病毒，从而有利于PEDV的持续感染。此外，PEDV似乎能够通过激活细胞外调节蛋白激酶（ERK），c-Jun N末端激酶（JNKs）和p38促分裂原活化蛋白激酶的三个信号通路来激活细丝。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）使活化的MAPK迅速转运至细胞核，并参与细胞增殖，分化，转化和凋亡，从而促进PEDV在靶细胞中有效繁殖病毒[23]。由此，可以推断出PEDV复制和随后的病理学变化依赖于PEDV能够利用多种细胞内过程，如细胞凋亡、MAPK信号传导和内质网应激。

2 PEDV核酸疫苗

核酸疫苗安全且时效性强，与亚单位疫苗和减毒疫苗相比，可以更好地刺激人体的体液和细胞免疫反应。核酸疫苗是通过基因工程方法开发的新型疫苗。其实质是将编码病原微生物特异性抗原蛋白的外源基因直接引入动物细胞，并通过宿主细胞表达抗原蛋白以诱导人体产生特异性免疫应答。这种疫苗可以激活不同的免疫途径，首先激活MHCⅠ和MHCⅡ分子，然后激活T细胞或间接激活B淋巴细胞产生抗体。

2.1 PEDV S蛋白核酸疫苗研究

Yin等[24]使用EGFP真核表达载体构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP7.S，包含了猪轮状病毒（PoRV）VP7蛋白和PEDV S蛋白。免疫小鼠并进行体液免疫测试，发现重组核酸疫苗pPI-2.EGFP.VP7.S可以诱导免疫小鼠产生针对PEDV的特异性抗体。同时，细胞免疫试验发现，免疫组诱导T淋巴细胞增殖，促进IL-4和IFN-γ细胞因子的分泌，其分泌能力明显高于空白对照组。Meng等[25]使用编码PEDV S蛋白的基因制备了核酸疫苗pIRES-（TGEV-S1-PEDV-S），可以刺激人体产生更高水平的体液和细胞免疫反应。Suo等[26]用真核表达载体pVAX1分别构建了含PEDV S和IL-18的重组核酸疫苗pVAX1-（PEDV-S）和pVAX1-（IL-18），免疫小鼠后，用PEDV特异的ELISA试剂盒分析体液免疫和细胞免疫状况，MTT法检测特异性淋巴细胞增殖试验，发现联合免疫诱导产生的IFN-γ、IL-4以及PEDV抗体水平均显著高于单独免疫组，表明IL-18可以作为细胞因子佐剂增强核酸疫苗的免疫原性。

2.2 PEDV S1蛋白核酸疫苗研究

Meng等[25]使用编码PEDV S1蛋白的基因制备了核酸疫苗pIRES-（TGEV-S1-PEDV-S1）。pIRES-（TGEV-S1-PEDV-S1）可以刺激人体产生高水平的体液和细胞免疫反应，并能诱导一定的中和抗体产生。Suo等[26]用真核表达载体pVAX1分别构建了含PEDV S1和IL-18的重组核酸疫苗pVAX1-（PEDV-S1）和pVAX1-（IL-18），将2种重组核酸疫苗单独或联合免疫小鼠，采取PEDV特异的ELISA试剂盒分析体液免疫和细胞免疫状况，MTT法检测特异性淋巴细胞增殖试验。结果发现，pVAX1-（PEDV-S1）/pVAX1-（IL-18）联合免疫诱导产生的IFN-γ、IL-4以及PEDV抗体水平均显著高于单独免疫组，表明IL-18可以作为细胞因子佐剂增强核酸疫苗的免疫原性。

3 讨论

李乐等[27]对新城疫病毒F基因优化并构建真核表达载体质粒，免疫SPF鸡后发现可以诱导细胞免疫应答。由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的，可预防H5亚型禽流感的DNA疫苗是中国首个DNA疫苗产品，已获批在动物中使用[28]。新冠S蛋白的重组质粒DNA疫苗在健康成人Ⅰ期临床试验中也表现出良好的安全性和免疫原性[29]。核酸疫苗的优点主要有：（1）DNA高度稳定和灵活，在大流行期间修改相关的质粒序列，即能够快速地制备相关疫苗；（2）核酸疫苗质粒可以通过多种途径转染至宿主细胞，通过将质粒注射入肌肉、真皮或黏膜表面即可诱导免疫反应；（3）可与多种疫苗共同使用，且持续时间长：动物机体内安全性好，无不良反应，不存在致病性；（4）吸收质粒DNA的肌细胞和单核细胞，能够刺激产生相应的免疫应答；（5）核酸疫苗比较稳定，便于储存和运输。但是由于核酸疫苗免疫原性较低导致该类型的疫苗并未得到快速发展，因此近几年对核酸疫苗的研究主要集中于如何提高其免疫原性。研究发现使用更加有效的启动子、对抗原基因进行密码子优化、将编码佐剂的基因与抗原基因共同表达以及改变免疫接种策略等均可在一定程度上提高核酸疫苗的免疫效力[30]。质粒DNA本身携带的CPG基序，也具有一定的佐剂功能。通过增加不同类型的佐剂分子与核酸疫苗质粒共同使用，可以使免疫调节因子保持持久低水平的产生，从而增强核酸疫苗的免疫效果。由此来看，研制出高效、安全的核酸疫苗是亟待解决的关键性问题。

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（2021–05–13）

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