张旺，王伟林

（1.浙江大学医学院，浙江 杭州；2.浙江大学医学院附属第二医院肝胆胰外科，浙江 杭州）

0 引言

胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤疾病，其起病隐匿，病死率高，预后极差。胰腺癌有多种分类，其中85% 左右均为胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）[1]。近年来尽管胰腺癌的治疗手段有了较大的进展，除手术治疗技术不断发展外，术前术后放化疗方案也有了进一步的完善，另外还可以结合分子靶向治疗加强疗效，但胰腺癌的治疗仍是一个巨大的挑战，其生存预后仍未能明显改善，5 年生存率仅约7%[2]。在未来数十年内，胰腺癌将成为西方国家肿瘤相关死亡率的第二大原因[3]。而在中国，尽管目前胰腺癌发病率及病死率未排入前五名，但随着中国人群生活方式逐渐西方化，胰腺癌发病率正在逐渐上升[4]。因胰腺癌在疾病早期常无明显临床症状，且疾病进展迅速，大多数患者在确诊时已处于肿瘤晚期，仅约20%的患者在确诊时仍有手术切除机会[5]。而即使在可手术切除的患者中，也有许多在术前就存在着肿瘤微转移灶，因此尽管外科手术已完整切除病灶，患者术后也有极高的肿瘤复发和转移风险。胰腺癌的不良预后由许多因素共同导致，其中胰腺癌对化疗药物的耐药性扮演着重要角色。目前手术切除联合系统性化疗是唯一有机会延长胰腺癌患者生存期的方法，而实际上在许多胰腺癌患者中都可以观察到对以吉西他滨为主的化疗药物的耐药性[6]。

胰腺癌的化疗药物耐药性部分是由于患者黏蛋白（mucin）的表达异常导致的。黏蛋白是在机体内广泛存在的一类糖蛋白，它的异常表达会在细胞外形成网格状的屏障，从而阻止化疗药物到达靶向部位[7-11]。目前已有许多研究关注黏蛋白与胰腺癌的相关性，却少有研究去探索黏蛋白合成过程中的催化酶在胰腺癌中所起的作用。其中由GCNT3 基因编码表达的GCNT3 蛋白，即β-1，6-N- 乙酰氨基葡萄糖转移酶（beta 1，6 N-acetylglucosaminyltra nsferase），是参与黏蛋白合成过程中起着重要作用的酶类之一，GCNT3 蛋白的活性影响着机体许多重要的生理过程，包括炎症反应、细胞凋亡、免疫反应等[12]。GCNT3 的异常表达会导致黏蛋白的过度表达，形成异常的分子屏障，进而导致胰腺癌的不良预后和化疗药物耐药性[13-16]。本文旨在阐述GCNT3 在胰腺癌中的研究进展，以求探索提高胰腺癌治疗效果，改善预后的新途径。

1 黏蛋白与GCNT3

黏蛋白（mucin）主要由糖类和蛋白质组成，是一类包含许多亚型的高分子量糖蛋白家族。目前已发现21 种人类黏蛋白，分别命名为MUC1-MUC21，共分为分泌型和跨膜型黏蛋白两大类[17]。其中跨膜型黏蛋白主要包括MUC1、MUC12、MUC13 等，它们在细胞间信号传导、细胞间相互作用等一系列生理过程中起着重要作用。分泌型黏蛋白主要包括MUC2、MUC5、MUC6 等，它们的主要作用是参与形成粘膜层，覆盖在上皮细胞表面，保护上皮组织免受炎症、感染等不利因素的损伤[18]。当前已有许多研究发现，黏蛋白的异常表达与肿瘤细胞的生长、分化、转移等有着密切的关系，通过多种途径导致许多恶性疾病[12]。

上皮细胞间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被认为是肿瘤发生发展的重要机制之一，当前已有研究表明跨膜黏蛋白的过表达可能通过破坏上皮细胞的极性和细胞间相互作用，进而破坏细胞间的紧密连接和黏附作用，促进EMT 的发生，使肿瘤细胞具备干细胞样的特征和侵袭能力[17,19-21]。黏蛋白家族具备众多亚型，在人体各种生理过程中扮演着复杂而重要的角色，这一特点决定了一种黏蛋白可在多种恶性肿瘤中起着推动作用，而在同种肿瘤中也可存在多种黏蛋白亚型的异常表达。例如Jonckheere N 等人在卵巢、乳腺、肺、结肠等恶性肿瘤标本中都发现了MUC1 的过表达[10]。而仅在胰腺癌中就可发现多种黏蛋白的过表达，包括MUC1、MUC4 和MUC16，另有研究发现，MUC1的过表达与胰腺癌患者总体生存期缩短相关[9，10，12]。黏蛋白的功能复杂多样，大部分黏蛋白都被发现与肿瘤生长相关，然而并非完全如此。MUC2 是消化道粘膜层的主要组成部分，Velcich A 等在MUC2 基因敲除小鼠模型中发现在外界不利因素的刺激下，MUC2的缺失与肠道上皮细胞增殖相关，出现肠道上皮形态及细胞迁移异常，小鼠更易发展为肠道恶性肿瘤，提示MUC2 具有抑制肿瘤生长的保护作用[22]。除此之外，黏蛋白还用于指导肿瘤的诊断与检测，卵巢癌相对特异性肿瘤标志物癌胚抗原CA125 即是黏蛋白亚型之一，MUC16。MUC16 在约80%的卵巢上皮性肿瘤中可出现过表达，升高的MUC16 可在患者血清中被检测到，目前广泛应用于临床卵巢癌的早期检测[23,24]。

大部分黏蛋白核心聚糖成分为O-连接型聚糖，包括N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）、N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）等成分，其中GalNAc 包含8 种核心结构，分别命名为核心结构1-8（Core1-8）。GCNT3 基因位于15 号染色体q22.2 区域，包含3 个外显子和2 个内含子，其表达产物GCNT3 蛋白便是催化O-连接型聚糖合成过程中的关键酶之一，可分别催化Core1 和Core3 转化为Core2和Core4，促进黏蛋白核心聚糖的形成[12,25]。通常情况下GCNT3主要在消化道内高表达，催化合成黏蛋白为上皮细胞提供保护作用，有研究发现GCNT3 基因敲除的小鼠模型会出现消化道内黏膜屏障功能减弱[26]。而GCNT3 的异常表达则会导致黏蛋白的异常合成，最终增加肿瘤细胞流动性，使其在肿瘤微环境中生存能力增强[12，14，27，28]。除胰腺癌之外，目前已有研究发现GCNT3 的异常表达与多种恶性肿瘤相关。Qian Li 等人研究发现，GCNT3 在非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）细胞中存在过度表达，且与肿瘤不良预后显著相关[29]。而Liu T 等人在肝癌细胞系及其原位异体种植肿瘤中亦发现GCNT3 表达升高[30]。此外，GCNT3 还在肾透明细胞癌、黑色素瘤、胃癌、卵巢癌等恶性肿瘤细胞中出现表达量升高[12，31，32]。然而在另一些恶性肿瘤中，GCNT3却表现出抑制肿瘤生长进展的活性。Huang MC 等人研究发现，在体外实验中上调结肠癌细胞的GCNT3 表达可以抑制肿瘤细胞增殖、黏附，降低细胞侵袭性，而在体内实验中上调GCNT3 的表达则可抑制肿瘤生长[33]。而在Margarita 等人的研究中同样发现，结肠癌标本的GCNT3 表达明显比正常结肠组织降低，且GCNT3 低表达与结肠癌术后复发率升高显著相关，GCNT3 可作为预测结肠癌预后的标志物[28]。在卵巢癌中，GCNT3 的表达同样可以削弱卵巢上皮细胞癌细胞的增殖、侵袭特性，还可以提高转移性卵巢癌细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性[34]。

2 GCNT3 与胰腺癌

2.1 GCNT3 与胰腺癌的发生及预后

为探索GCNT3 在胰腺癌中的表达情况，Chinthalapally V. Rao等人[14]分别获取了Kras 基因突变诱导的胰腺癌小鼠模型和野生型小鼠的胰腺组织，通过PCR 扩增后分析发现，与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中GCNT3 的信使RNA（mRNA）表达量明显升高。另外对人类胰腺癌标本GCNT3 的免疫组化分析和黏蛋白染色发现，在胰腺导管腺癌和胰腺上皮内瘤变标本中GCNT3 和黏蛋白表达均有显著升高。此外通过转录组分析发现与野生型小鼠相比，在胰腺癌小鼠中GCNT3 的表达升高与MUC1、MUC4、MUC6、MUC16等黏蛋白表达增加显著相关，还与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）表达升高显著相关（P＜0.001）。为进一步证实GCNT3 在胰腺癌中的作用，研究者在通过CRISPR-Cas9技术敲除胰腺癌细胞的GCNT3 基因后通过MTT 比色法测定细胞存活率，发现敲除GCNT3 基因后，胰腺癌细胞活性显著下降，2 天后细胞增殖相对减少达55%，同时还表现出细胞成球能力明显下降。先前已有研究表明，正常的胰腺组织并不表达GCNT3[16]，而在小鼠胰腺癌模型和人类胰腺癌组织中均观察到了GCNT3 的过表达。以上结果都提示GCNT3 作为黏蛋白合成过程中的关键酶之一，它的过量表达与胰腺癌的发生发展有着密不可分的关系。

为了进一步探索GCNT3 与胰腺癌患者生存预后的关系，Chinthalapally V. Rao 等人[14]对90 例胰腺癌标本及其对应的正常胰腺组织进行了GCNT3 的免疫组化分析，并结合患者随访数据进行分析。分析结果发现与GCNT3 高表达患者相比，GCNT3低表达的患者总体生存期明显更长（中位生存期：17.5 月vs10.5月，p=0.036），提示GCNT3 的表达与胰腺癌患者生存期缩短相关，GCNT3 可作为预测胰腺癌总体生存期的肿瘤标记物。此外，在GCNT3 高表达的患者中发现多达62.9%的患者有吸烟饮酒或糖尿病史，提示这些相关病史可能与促进GCNT3 表达相关。

2.2 GCNT3 与胰腺癌的治疗

由于认识到GCNT3 在黏蛋白合成中的作用，以及它的异常表达在胰腺癌发生及进展中所起的重要作用，使得GCNT3 有望成为胰腺癌治疗的新靶点。得益于GCNT3 的晶体结构已被发现，Chinthalapally V. Rao 等人[14]通过计算机小分子对接模拟发现了能与GCNT3 选择性非竞争性结合的抑制剂他尼氟酯（talniflumate），对接预测结果表明两者间可能通过三个氢键结合。他尼氟酯是一种尼氟酸类药物，作为一种非甾体类解热镇痛药，可用于辅助治疗各种风湿性疾病[35]。此外，他尼氟酯作为一种钙离子激活的氯通道阻滞剂，可以在动物模型和细胞系中抑制黏液的过度分泌，因此在治疗呼吸系统疾病方面也具有应用前景[36,37]。而在Chinthalapally V. Rao 等人的胰腺癌小鼠体内实验中发现，与对照组小鼠相比，使用他尼氟酯治疗一周后的胰腺癌小鼠在胰腺内的黏蛋白和GCNT3表达量显著降低，同时GCNT3 蛋白（P＜0.04）和mRNA（P＜0.03）表达量均较对照组明显降低。以上结果均表明他尼氟酯可以在小鼠模型中抑制GCNT3 和黏蛋白的表达。在胰腺癌细胞系的实验中进一步发现，经他尼氟酯处理后的胰腺癌细胞出现了明显的细胞活力降低，GCNT3 和黏蛋白的表达也较对照组显著降低。而当他尼氟酯和EGFR 抑制剂吉非替尼（gefitinib）联用时，对胰腺癌细胞GCNT3 和黏蛋白表达的抑制作用更明显，提示他尼氟酯不仅自身可能有抑制胰腺癌进展的作用，还可增强胰腺癌对吉非替尼的敏感性，从而可以减少吉非替尼用药剂量，减轻药物毒性。截至目前，他尼氟酯在细胞实验和动物模型实验中通过抑制GCNT3 表达进而抑制胰腺癌发展的效果显著，但未来若要应用于临床胰腺癌的辅助治疗，还需要更多相关研究的支持。

GCNT3 作为黏蛋白合成复杂过程中的重要一环，还可能通过其他途径抑制其表达，提高胰腺癌疗效。Qian Li 等人[29]通过miRNA 免疫沉淀和双萤光素酶实验发现miRNA 之一miR-302b-3p 的直接作用靶点是GCNT3 基因，miR-302b-3p 与GCNT3 的mRNA 可形成牢固的结合，他们发现NSCLC 细胞内miR-302b-3p的表达与GCNT3 表达水平呈显著的负相关，miR-302b-3p 在蛋白质水平通过抑制GCNT3 表达以减弱NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭能力。进一步的实验发现，miR-302b-3p/GCNT3 通路的下游分子包括E-cadherin、N-cadherin、cyclin D1 和p-Erk 等，由此推测miR-302b-3p/GCNT3 通路可能通过激活ERK 信号通路和EMT途径调节NSCLC 细胞的肿瘤活性，使得miR-302b-3p/GCNT3 通路有望成为NSCLC 治疗的新靶点。而目前还没有miR-302b-3p/GCNT3 通路在胰腺癌中相关研究，通过促进miR-302b-3p 的表达进而抑制GCNT3 有望成为将来改善胰腺癌疗效的新靶点。

3 小结

胰腺癌作为一种高度恶性肿瘤，因早期无明显的临床症状，而且疾病进展迅速，具有极高的复发转移潜能，使胰腺癌成为死亡率极高的恶性肿瘤之一。尽管目前手术切除联合标准辅助化疗是胰腺癌的最佳选择，但疗效仍然十分有限。因此，探索胰腺癌诊断及治疗的新途径是十分迫切的任务。GCNT3 蛋白作为黏蛋白合成过程中的关键酶之一，近年来已有研究发现抑制GCNT3 表达可破坏黏蛋白的异常表达，从而减少胰腺癌对化疗药物的耐药性，提高胰腺癌疗效。此外，基础实验中也表明GCNT3 的表达抑制可以减弱胰腺癌细胞的肿瘤特性，并且证实了GCNT3 选择性抑制剂他尼氟酯对胰腺癌的抑制作用。但GCNT3 在胰腺癌中的具体作用机制还有待一进步的研究阐明，针对GCNT3 途径的胰腺癌治疗手段还需要更多的探索。我们相信，随着未来研究的进展，GCNT3 在胰腺癌中的作用机制将会逐渐揭晓，更多相关的药物逐渐会被发现、应用，GCNT3 在未来有望成为胰腺癌诊断、治疗的全新途径，为改善胰腺癌疗效提供更大的支持。