牛明 于歌

乳腺癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤，据统计在世界范围内每年大约2 088 849新发病例和626 679死亡病例[1]。尽管手术、放化疗等治疗方式不断进步，但乳腺癌的生存率并没有显著的改善[2]。因此，需要从基因水平方面发现更多的肿瘤标记物，为乳腺癌的治疗提供靶点，进一步改善乳腺癌患者的生存率。

Gankyrin由重复的ankyrin序列构成[3]。研究表明Gankyrin可以结合并磷酸化Rb，释放激活的转录因子E2F1[4-5]。Gankyrin能够通过与MDM2结合，介导泛素/26S蛋白酶体对p53的降解[6]。在DEN诱导的小鼠模型中，Gankyrin促进C/EBP蛋白泛素化诱导肝癌发生[7]。体内实验也验证了Gankyrin可以降解Rb、P53、C/EBP和HNF4导致肝癌的发生[8]。另外，Gankyrin可以通过激活Ras通路促进肺癌发生[9]。近期研究还发现Gankyrin参与糖酵解和谷氨酰胺代谢加快肿瘤进展[10-11]。Gankyrin在多种癌症组织中过表达，包括乳腺癌[12]、子宫内膜癌[13]、肝癌[14]、结直肠癌[15]和食管癌[16]。然而Gankyrin表达与乳腺癌患者的临床病理因素及作用机制尚不明确。本研究先通过数据库分析Gankyrin与乳腺癌患者临床病理因素及预后的相关性，再利用乳腺癌细胞系敲减和过表达分析Gankyrin在乳腺癌发生发展过程中的分子机制。

1 材料和方法

1.1 数据库分析

通过UALCAN(http：//ualcan.path.uab.edu/)，GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn)，Kaplan-Meier Plot(http：//kmplot.com)分析Gankyrin在乳腺癌患者中基因表达情况及其与患者总生存期(Overall survival，OS)和无进展生存期(Progression free survival，PFS)的相关性。通过MethHC tool(http：//methhc.mbc.nctu.edu.tw)分析TCGA数据库中Gankyrin基因及启动子甲基化的相关性。OS为随机化开始至死亡的时间；PFS指随机化开始至肿瘤进展或死亡的时间。

1.2 细胞培养与转染

乳腺癌细胞系BT549和MDA-MB-231购买于上海中科院细胞库，细胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，并于37℃含5% CO2的温箱中培养。在BT549细胞转染Gankyrin过表达病毒和阴性对照病毒，得到对照组549Flag细胞和过表达组549Ad-Gankyrin细胞。在MDA-MB-231细胞分别转染RNA干扰siGENOME SMARTpools和Non-Targeting siRNA各0.1 μM，得到对照组231NC细胞和敲减组231siGankyrin细胞。

1.3 实时荧光定量PCR

利用TRIzol提取细胞RNA，利用PrimeScriptTM RT Master Mix进行逆转录，按照SYBR®Premix Ex TaqII RT-PCR试剂盒进行实时荧光定量PCR检测。引物合成购自长春库美公司。引物序列为：Gankyrin：F 5′-AGCAGCCAAGGG-TAACTTGA-3′；R 5′-CCAGCAGTTTTGCTTCTTCC-3′；GAPDH：F 5′-GGA-GCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，R 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.4 CCK-8实验

将细胞置于96孔板每孔接种细胞2 000个。培养24 h待细胞贴壁后加入CCK-8试剂，1 h后利用酶标仪检测450 nm处的OD值，绘制细胞增殖曲线。

1.5 流式细胞检测

利用APC-CD44和PE-CD24，用预冷的PBS将转染的细胞洗涤3遍后，离心收集，加入1×Binding Buffer重悬细胞，按照说明各加入5 μL的PC-CD44和PE-CD24孵育10～15 min，利用FACSCanto II检测CD24-/CD44+细胞比例。

1.6 迁移和侵袭检测

将转染后的细胞置于Tanswell小室上室(104个/孔)，下室加入含有20%胎牛血清的培养基，放入培养箱培养24 h，将小室用结晶紫染色后PBS清洗，利用显微镜选取5个良好视野拍照计数，取平均值计算细胞迁移的最终结果。小室上加入基质胶重复上述步骤计算细胞侵袭的结果。

1.7 统计学分析

运用SPSS软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间采用t检验，多组间比较采用方差分析，重复测量资料采用重复测量方差分析，组间多重比较用SNK法，相关性分析采用Spearman秩相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Gankyrin在乳腺癌过表达与患者预后的关系

首先通过UALCAN分析Gankyrin在乳腺癌中的表达情况。结果表明与正常乳腺组织相比，Gankyrin在乳腺癌组织中高表达(图1A)(P<0.01)，同时Gankyrin高表达与较差的OS明显相关(图1B)(P=0.004)。为了进一步验证上述结论，利用GEPIA分析发现，Gankyrin高表达与患者较差OS明显相关(图1C)(P=0.004)。Kaplan-Meier Plot分析显示Gankyrin高表达患者其PFS(图1D)(P<0.001)和OS(图1E)(P=0.062)都较差。因此，Gankyrin可以作为乳腺癌患者预测预后的标志物。

2.2 Gankyrin的表达与启动子甲基化的关系

本研究利用MethHC tool分析乳腺癌及乳腺正常组织中Gankyrin启动子甲基化水平。结果表明，与乳腺癌组织相比，乳腺癌中Gankyrin启动子甲基化水平较低(图2A)(P<0.01)，并且乳腺组织及癌组织中Gankyrin的甲基化水平与其mRNA表达呈负相关(图2B)(r=-0.258，P<0.01)，表明Gankyrin在乳腺癌组织表达水平升高部分是由于其启动子低甲基化所导致的。

2.3 Gankyrin与乳腺癌细胞增殖的关系

在MDA-MB-231细胞系进行Gankyrin敲减后，与对照组相比，敲减组Gankyrin mRNA表达明显下降(P<0.01)(图3A)。CCK-8结果表明两组细胞活力值存在统计学差异(F=4.622，P=0.032)，5天后敲减组细胞增殖明显低于对照组(P<0.01)(图3B)。在BT-549细胞系进行Gankyrin过表达后，与对照组相比，高表达组Gankyrin mRNA表达明显上升(P<0.01)(图3A)。CCK-8结果表明两组细胞活力值存在统计学差异(F=49.101，P=0.006)，5天后过表达组细胞增殖明显高于对照组(P<0.01)(图3C)。

图1 乳腺癌患者Gankyrin的表达情况及其与预后的关系Figure 1 The high expression of Gankyrin was related to the poor prognosis of patients with breast cancerNote：A.The expression of Gankyrin in normal breast tissues and breast cancer tissues；B.The expression of Gankyrin in breast cancer based on lymph node metastases；C.The expression of Gankyrin in breast cancer based on the stages；D.Effect of Gankyrin expression on breast cancer patient survival；E.The expression of Gankyrin and survival analysis was performed by GEPIA；F and G.Survival analysis of Gankyrin in breast cancer was performed at the online website Kaplan-Meier Plotter.**P<0.01，when compared with the normal group.

图2 Gankyrin启动子甲基化与其在乳腺癌表达的关系Figure 2 The Gankyrin promoter was hypermethylated in breast cancer tissues in the TCGA databaseNote：A.Comparison of average methylation values of Gankyrin gene in normal and breast cancer samples；B.The correlation between promoter methylation value and mRNA expression of Gankyrin in breast cancer by Pearson.**P<0.01，when compared with the normal group.

图3 Gankyrin促进乳腺癌细胞增殖Figure 3 The effect of Gankyrin on cell proliferation of breast cancerNote：A.Knockdown and overexpression efficiencies of Gankyrin were confirmed by qPCR；B.Gankyrin silencing inhibited the proliferation of MDA-MB-231 cells；C.Overexpression of Gankyrin promoted the proliferation ability in BT-549 cells.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the control group.

2.4 Gankyrin与乳腺癌细胞转移和侵袭的关系

Transwell结果显示敲减Gankyrin可以降低MDA-MB-231细胞的转移和侵袭能力(图4A，图4B)(P<0.01)。而过表达Gankyrin能促进BT-549细胞的转移和侵袭能力(图4C，图4D)(P<0.05)。

图4 Gankyrin促进乳腺癌细胞转移和侵袭Figure 4 Gankyrin promoted the migration and invasion of breast cancer cellsNote：A.and B.The Changes of cell migration and invasion abilities were measured after Gankyrin silencing in MDA-MB-231 cells；C.and D.The Changes of cell migration and invasion abilities were measured after Gankyrin overexpression in BT-549 cells.*P<0.05，**P<0.01，when compared with the control group.

2.5 Gankyrin与肿瘤干细胞比例的关系

CD24-/CD44+细胞具有乳腺癌肿瘤干细胞特征。流式细胞检测发现，敲降Gankyrin后的MDA-MB-231细胞中，CD24-/CD44+细胞比例明显下降(图5A)(P<0.01)。而在过表达Gankyrin的BT-549细胞中，CD24-/CD44+细胞比例明显上升(图5B)(P<0.01)。

图5 Gankyrin增加乳腺癌肿瘤干细胞比例Figure 5 Gankyrin increased the percentage of cancer stem cell populationNote：A.Knockdown Gankyrin decreased CD24-/CD44+ proportion in MDA-MB-231 cells；B.Overexpression Gankyrin increased CD24-/CD44+ proportion in BT-549 cells.**P<0.01，when compared with the control group.

3 讨论

Gankyrin又名p28GANK，或26S蛋白酶体非ATP酶亚基(PSMD10)，位于人类染色体Xq22.3上，全长约1.5 kb，编码由226个氨基酸组成的蛋白质。Gankyrin最初发现于肝癌，随着研究的深入，发现其在多种癌症中过表达并与患者较差的预后相关，包括子宫内膜癌、结直肠癌、食管癌和肝癌等[13，15-18]。Gankyrin可以抑制P53及Rb等多种抑癌基因，促进肿瘤进展，同时其可以调控多种信号通路。研究表明Gankyrin过表达可以激活AKT信号通路，不仅可以诱导内质网应激抑制肿瘤细胞凋亡[19]，而且还能够提高β-catenin活性，促进肿瘤形成[20]。Gankyrin可以激活STAT3信号通路，诱导肿瘤细胞上皮间质转化及基质金属蛋白酶的表达进而促进肿瘤细胞转移，同时上调CyclinD1表达促进肿瘤细胞增殖[14，17]。Gankyrin与NF-kB/RelA相互作用，抑制NF-kB/RelA向核内转运，进而抑制其活性[21]。因此，Gankyrin可以参与多种信号通路，调控肿瘤细胞的生物学功能。

本研究结果显示，与正常乳腺组织相比，Gankyrin在乳腺癌组织中表达明显增高，我们进一步分析了Gankyrin表达与表观遗传的关系，发现乳腺癌组织Gankyrin表达增高与其启动子甲基化水平较低具有相关性。利用多个数据库分析Gankyrin表达与乳腺癌患者预后的相关性，结果显示Gankyrin高表达的乳腺癌患者其预后较差，表明其在乳腺癌中发挥癌基因作用，可以促进乳腺癌进展。通过分子实验表明，Gankyrin可以增强乳腺癌细胞增殖和转移能力，这与该基因在其它癌症的研究结果相似。众所周知，肿瘤的转移与上皮间质转化密切相关[22]。Fu等[17]发现Gankyrin可以诱导肝癌细胞上皮间质转化从而促进癌细胞转移。近期研究表明Gankyrin能够上调低氧诱导分子和Rac1表达进而促进乳腺癌转移[12，23]，本研究结果进一步验证了上述结论。

肿瘤干细胞具有较强的自我更新和分化能力，因此具有高致瘤性，对放化疗抵抗的特征，其在癌症的发生和进展中发挥重要作用。Qian等[24]发现Gankyrin可以通过降解Oct-4维持肝癌肿瘤干细胞特征。但是该基因是否参与调控乳腺癌肿瘤干细胞尚未有报道。乳腺癌肿瘤干细胞分子标志物为CD24-/CD44+，本实验在乳腺癌细胞中敲降Gankyrin后，CD24-/CD44+细胞比例明显下降；而过表达该基因后，CD24-/CD44+细胞比例上升，表明Gankyrin对于维持乳腺癌肿瘤干细胞特征具有重要作用，其成瘤性及具体机制仍需要进一步的研究。

综上所述，通过分析发现Gankyrin在乳腺癌表达增高并且与患者的不良预后相关。乳腺癌组织Gankyrin启动子甲基化水平降低与其表达增高明显相关。Gankyrin可以促进乳腺癌细胞增殖和转移，维持肿瘤干细胞特征。因此，Gankyrin在乳腺癌的发生发展过程中起到重要作用，基于Gankyrin关键分子的靶向治疗有待进一步探索。