王灿 罗茜 罗焱 刘素桃 余音 刁庆春 黎智 李晶

黑色素瘤(Malignant melanoma，MM)是指原发于皮肤的恶性黑色素瘤，在皮肤肿瘤的占比约3%，死亡率高达65%，其全球发病率和死亡率逐年上升[1]。其早期即可发生淋巴转移和血性转移，而转移患者对放化疗敏感性差，预后极差；目前缺乏疗效确切、行之有效的防治方案[2-3]。因此寻找黑色素瘤发病和转移的生物标志物和靶点具有重要的临床意义，以期开发新的治疗黑色素瘤的方法。有研究显示MSX1在肺癌、胃癌、儿童急性T淋巴细胞白血病等肿瘤中异常表达[4-7]，作为抑癌基因参与肿瘤的进展，但在黑色素瘤中尚未见报道。

1 资料与方法

1.1 细胞培养和材料仪器

人黑色素瘤细胞系HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s和正常皮肤色素痣细胞FF均购自美国ATCC细胞库；实验所用细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液(购自美国Gibico公司)在恒温37℃，5% CO2的培养箱中进行培养；一抗及二抗(MSX1，active-β-catenin，c-Myc，Cyclin D1和p21)和二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购自美国 Abcam 公司；MSX1引物由华大基因公司设计并合成；逆转录试剂盒和荧光PCR试剂盒均购自美国生物应力公司；实时荧光定量PCR仪购自ProteinSimple公司；基质胶购自Millipo公司。

1.2 临床组织样本

选取2011年1月—2017年12月重庆市中医院皮肤科治疗的黑色素瘤患者的手术样本和病理资料：包括30例色素痣样本和50例恶性黑色素瘤样本(包括肿瘤组织和癌旁正常组织，其中原发灶45例，转移灶5例)；本研究通过重庆市中医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书；所有临床组织样本病理检查均由我院病理科副高及以上职称医师诊断和提供。

1.3 实验方法

1.3.1 RNA和蛋白提取 黑色素瘤细胞系消化离心，收集上述皮肤恶性黑素瘤、色素痣组织样本并研磨成粉，取50～100 mg组织样品，加入1 mL TRIzol 试剂抽提组织样本中总 RNA[8]。提取后RNA在Landdrop仪器中测得浓度，通过RNA逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，实验方法及步骤参考样品实验说明书及已有的参考文献[8]。将逆转录后的cDNA放于-20℃冰箱中保存。

1.3.2 MSX1过表达载体构建，细胞转染和在线数据分析 细胞转染的基础同已有的文献报道[9-10]。选取MSX1 mRNA表达量最低A375细胞为研究载体，活性状态下的A375种于六孔板，细胞融合度生长至约70%～80% 时进行相应功能实验。以Lipofectamine-2000(Thermo Fisher Scientific)为载体，转染pcDNA3.1(+)-Flag-MSX1质粒(实验组)和pcDNA3.1(+)-Flag-vector(对照组)，转染48h后收集细胞提取RNA并进行细胞功能实验。通过GEPIA2数据库(http：//gepia.cancer-pku.cn/)分析基因的相对表达与预后的关系(版本号：GEPIA2 2019)；总生存期(Overall survival，OS)指从诊断开始至因任何原因引起死亡的时间。无病生存期(Disease-free survival，DFS)定义为从诊断开始至疾病复发或(因任何原因)死亡的时间。

1.3.3 qRT-PCR检测MSX1在黑色素瘤中的表达 实时荧光的相对表达分析PCR扩增程度，以扩增指数期为起始模板进行半定量分析；扩增指数越高，mRNA的相对表达越高。实验组和对照组独立重复三次。实验中所用的引物序列：MSX1-F：5′-CTACGCTCCGTGAGATGTGCT-3′，MSX1-R：5′-TAGCACTCAGTATGATAACTA-3′。

1.3.4 免疫组织化学法 免疫组织化学实验包括[11]：(1)样本石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(PH7.4)冲洗三次，每次5 min；(2)对组织抗原进行相应的修复(10 min)；(3)3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，孵育10 min；(4)PBS 冲洗三次，每次5 min；(5)滴加4%羊血清封闭，室温30 min，以减少非特异性染色；(6)孵一抗和二抗、DAB显色等。在倒置显微镜下随机五个视野，计算相对光密度。

1.3.5 甲基化PCR检测MSX1在黑色素瘤中甲基化 甲基化PCR的主要方法包括[12]：(1)收集黑色素瘤样本，蛋白酶K及RNA酶提取基因组 DNA；(2)分别加入糖苷配糖基，乙酸胺和的冰冻乙醇。-20℃过夜沉淀 DNA；(3)Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统修饰后DNA纯化回收；(4)修饰后DNA用于PCR；(5)PCR产物的凝胶回收；(6)PCR产物与T载体的连接和转化、白斑筛选。其中PCR反应体系：95℃变性5 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，72℃延伸4 min；总循环35个循环。

1.3.6 Transwell实验检测迁移和侵袭 迁移实验[13]：实验组和对照组细胞消化离心计数，取浓度为3×103个细胞/mL的RPMI-1640培养液植于Transuell小室，小室底部加入20%浓度胎牛血清1640培养液约700 μL；恒温孵育箱中培养24 h后取出小室，固定，染色，计数并评价细胞迁移能力。侵袭实验：实验前在Transwell小室中铺入无血清基质胶(无血清RPMI-1640基础培养液∶基质胶=1∶5)，放于恒温孵育箱中待其凝固后(约4～6 h)，进行侵袭实验，其余步骤同迁移实验；所有实验均重复三次。

1.3.7 蛋白质免疫印迹实验 收集实验组和对照组细胞，使用蛋白裂解液(每1 mL含800 μL T-PER蛋白抽提试剂、100 μL磷酸酶抑制剂和100 μL蛋白酶抑制剂)提取细胞蛋白[12，14]；通过BCA法测定蛋白浓度。50 μg/孔细胞蛋白用10%～12%SDSPAGE凝胶电泳分离，然后转移PVDF膜。4℃下孵育一抗(1∶100)过夜。第二天，二抗(1∶500)封闭液室温下摇床孵育2 h，显色剂(DAB)显色、成像仪曝光，并用Quantity One软件分析蛋白灰度值。

1.4 统计分析方法

运用SPSS 19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验，MSX1蛋白表达与临床资料关系、色素痣样、癌组织和癌旁组织间甲基化率的比较用卡方检验进行分析。生存曲线由GEPIA2数据库通过Kaplan-Meier法绘制，组间比较采用Log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MSX1在人黑色素瘤细胞系和组织中表达

与色素痣细胞FF相比，MSX1 mRNA在黑色素瘤细胞系(HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T和MDA-MB-435s)中均表达下调(图1A，F=22.12，P<0.001)，而在A375细胞中表达量最低。与色素痣组织相比，MSX1 mRNA表达水平在皮肤黑色素瘤(Cutaneous Malignant melanoma，CMM)组织和转移性黑色素瘤(Metastatic cutaneous melanoma，MCM)中表达下调，其中MSX1 mRNA在MCM中表达最低(图1B，P<0.001)。免疫组织化学法发现，MSX1蛋白在CMM和MCM组织中表达降低，与正常色素痣组织(0.623±0.045)相比，MSX1在CMM和MCM中的光密度(0.421±0.016)、(0.266±0.023)降低(图1C，P<0.001)，其中MSX1蛋白在MCM中表达最低。GEPIA2在线数据进一步分层研究大样本数据库发现，低表达MSX1与OS和DFS无关(图1D，P>0.05)。进一步分析发现，MSX1在CMM和MCM中的表达与性别、年龄、分级分期等基线特征无关(P>0.05)。

图1 MSX1在黑色素瘤细胞和组织中的表达及与预后的关系Figure 1 The expression of MSX1 in melanoma cells and tissues and its prognosisionNote：A.The expression of MSX1 mRNA was downregulated in CMM cell lines(***P<0.001，when compared with FF)；B.The expression of MSX1 mRNA was down-regulated in CMM and MCM tissues(***P<0.001，when compared with Nevi)；C.The expression of MSX1 protein was down-regulated in CMM and MCM tissues(***P<0.001，when compared with Nevi)(100×)；D.The data from online Gepia showed that the expression of MSX1 was not significantly correlated with OS and DFS.

2.2 MSX1在人黑色素瘤中甲基化表达

分析发现MSX1启动子存在CpG岛(图2A)；甲基化PCR(MSP)证实，MSX1启动子在黑色素瘤患者中甲基化率为92%(46/50例)，明显高于配对的癌旁组织的46%(23/50例)和正常的色素痣中的6.67%(2/30例)(χ2=57.52，P<0.01)(图2B)；因此，本研究推测MSX1基因启动子甲基化可能参与黑色素瘤的进程。

图2 MSX1在黑色素瘤组织中启动子甲基化表达Figure 2 The methylation of MSX1 in CMM and Nevi tissuesNote：A.CpG island of MSX1；B.MSP showed the methylation of MSX1 in paired CMM and nevus tissues.

2.3 MSX1过表达表达对人黑色素瘤细胞迁移和侵袭的影响

为验证MSX1能否作为抑癌基因参与黑色素瘤的发生发展，Transwell细胞迁移和侵袭实验分别检测转染了pcDNA3.1(+)-Flag-MSX1和pcDNA3.1(+)-Flag-Vector的黑色素瘤细胞A375；结果显示转染了pcDNA3.1(+)-MSX1的实验组A375细胞穿过小室的细胞显著低于对照组(图3，t=13.232，P<0.001；t=21.436，P<0.001)。

2.4 MSX1过表达表达对肿瘤干细胞标志物的影响

本研究通过RT-PCR和qRT-PCR实验发现，过表达MSX1后能抑制上皮间质转化(EMT)相关标志物表达如：E-cadherin(E-cad)升高(t=11.154，P<0.001)，Vimintin(Vim)降低(t=21.486，P<0.001)，N-cadherin(N-cad)降低(t=14.662，P<0.001)和EMT下游相关标志物如：STAT3(t=20.186，P<0.001)和OCT4(t=21.553，P<0.001)等mRNA的表达(图4A，4B，P<0.001)，因此我们推测MSX1可能通过调控EMT相关标志物从而影响肿瘤的迁移和侵袭。

2.5 重新表达MSX1对Wnt/β-catenin信号通路的影响

Western blot检测过表达MSX1后对active-β-catenin及下游靶基因的影响，结果显示过表达MSX1后，active-β-catenin(t=7.879，P<0.001)及下游靶基因c-Myc(t=16.612，P<0.001)，Cyclin D1(t=24.324，P<0.001)的表达明显受到抑制(图5A，5B，P<0.001)；c-Myc(t=20.166，P<0.001)，Cyclin D1(t=17.544，P<0.001)等mRNA表达水平降低(图5C，P<0.001)。因此，本研究提示MSX1能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路调控黑色素瘤的进程。

图3 MSX1过表达后能抑制黑色素瘤细胞A375迁移和侵袭Figure 3 Overexpression of MSX1 inhibited migration and invasion of A375 cellsNote：(A-B)The migration and invasion capacity of vector-or MSX1 cells，***P<0.001(×200).

图5 MSX1过表达后对Wnt/β-catenin信号通路的影响Figure 5 Overexpression of MSX1 disrupted the Wnt signaling pathwaysNote：A.Western blot；B.The analysis of protein bands.***P<0.001，when compared with the vector control group；C.The results of qRT-PCR.***P<0.001，when compared with the vector control group.

图4 MSX1过表达后能抑制黑色素瘤细胞A375上皮间质转化相关标志物表达Figure 4 Overexpression of MSX1 inhibited the EMT expression and its related markersNote：A.RT-PCR showed representative stem cell markers in MSX1-infected A375 cells.*Indicates significantly changed bands；B.qRT-PCR showed representative EMT related markers in MSX1-infected A375 cells.***P<0.001，when compared with the vector control group.

3 讨论

肿瘤迁移和侵袭是黑色素瘤治疗失败和癌症死亡的主要原因之一，寻找早期诊断和治疗黑色素瘤迁移和侵袭相关的分子靶点为其治疗提供了新的思路。EMT抵制凋亡和血管生成被认为是肿瘤细胞侵袭转移必经的三个步骤[15-16]。DNA甲基化在不同的肿瘤组织中具有相对特异性，抑癌基因启动子DNA异常甲基化是导致其表达降低或沉默的主要原因之一[17]。在恶性肿瘤细胞中DNA甲基化水平及模式的改变能通过影响染色质组的稳定性及基因组的表达从而促进肿瘤的生长和转移[18]，为肿瘤患者的“个性化”治疗提供参考。

MSX1基因位于4p16.1染色体上，属于同源异形盒家族，编码一种转录抑制因子，能与转录复合体的核心蛋白或者其他同源异形蛋白相互作用，在胚胎的发育过程中发挥重要作用；研究显示MSX1启动子DNA在肺癌、胃癌、儿童急性T淋巴细胞白血病等肿瘤中存在异常甲基化[4-7]，作为潜在的抑癌基因参与肿瘤的发生发展。但MSX1在黑色素瘤组织中表达、甲基化、预后、迁移/侵袭、干细胞表达等分层研究目前国内外尚无报道。

本研究结果显示，MSX1 mRNA在黑色素瘤细胞系和组织的表达下调，其蛋白在黑色素瘤组织中表达下调；提示MSX1可能作为肿瘤相关基因参与黑色素瘤的进程。MSP结果显示，与癌旁组织相比，MSX1在黑色素瘤组织样本中DNA甲基化升高，正常色素痣组织中低甲基化表达。DNA甲基化是恶性肿瘤的重要发展事件，提示MSX1可能作为黑色素瘤进程的重要甲基化基因影响其癌症进程和肿瘤发生；因样本量过低，尚需更多的样本量进行进一步的分析其表达与分期、预后等临床病理特征等联系。

EMT能使肿瘤细胞干细胞化，耐药性增强，降解基底膜和细胞外基质，促进血管生成，形成肿瘤微环境等导致肿瘤的侵袭和转移[19-20]。A375细胞过表达MSX1后细胞迁移和侵袭明显受到抑制，而MSX1能否调控EMT尚不清楚。本研究通过功能实验发现黑色素瘤细胞A375恢复MSX1基因表达后，细胞迁移和侵袭受到明显抑制。RT-PCR显示，过表达MSX1基因后的A375细胞中，EMT相关的标志物如：E-cad升高，Vim和N-cad表达下调；而其下游的STAT3和OCT4等标志物的mRNA表达下调。STAT3和OCT4是一组可以被不同的细胞因子或者生长因子激活的转录因子，其成员具有信号转导和转录调控双重功能，在接受外界信号刺激后激活并进入核内影响基因的转录[21-22]。而活化的STAT3和OCT4能够通过多种方式促进肿瘤的进展，如促进肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、耐药、EMT、调节肿瘤微环境、促进肿瘤干细胞的更新与分化等；其活化与肿瘤细胞的转移密切相关[22-23]。

Wnt/β-catenin信号通路在多种肿瘤恶性增殖、EMT、血管生成和转移发挥重要作用[24]。进一步对MSX1在黑色素瘤细胞中的生物学机制进行初步探索发现，MSX1能抑制Wnt/β-catenin信号通路的转导。过表达MSX1后的A375细胞，active-β-catenin及下游的调控靶点c-Myc，Cyclin D1的表达降低。c-Myc、Cyclin D1和STAT3协同调控EMT的表达或肿瘤的进程，其表达上调提示预后不良[25]。更值得关注的是，Wnt信号通路能够促进肿瘤细胞发生EMT，促进肿瘤细胞转移。因此我们推测MSX1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的转导抑制黑色素瘤迁移和侵袭。

综上所述，本研究首次证实了在黑色素瘤组织和细胞系中MSX1表达下调；MSX1通过调控Wnt/β-catenin信号通路的转导和EMT影响黑色素瘤的进程。有助于我们进一步的了解恶性黑色素瘤的发生发展及肿瘤分子调控机制，为其早期诊断及靶向治疗提供了新的思路和依据。