高雪峰，贾渊

内蒙古师范大学生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010020

根系分泌物是植物根系在生命活动过程中向外界环境中释放化学物质的总称。由于其组成复杂，种类繁多，因而具有多种生态功能（吴林坤等，2015）。根系分泌物不仅可以影响根际微生物群落结构，还可改变土壤的理化性状，并促进或抑制邻近其他植物的生长（林文雄等，2006；王树起等，2007）。根系分泌物中不同组分特别是特异性组分对植物本身以及根际土壤生态环境均产生着重要的影响（Kateryna et al.，2018）。土壤微生物又是土壤生态环境中最为重要且对环境变化极其敏感的生物活性因子。它们以其所具有的生物化学活性，积极参与土壤中物质的转化过程，为植物提高有效养分，同时也是土壤中各种生物化学和生理学过程动态平衡的重要调节者（Buckley et al.，2001；Sun et al.，2004）。可是，由于根系分泌物量少、成分复杂，其组分的准确鉴定以及有效组分的确定对于根系分泌物功能的实际应用是最为重要且最为缺乏的关键环节（Hu et al.，2018）。

根系分泌物中的有机酸在植物养分活化与吸收过程中有着重要的作用。最常见的有机酸分泌物有柠檬酸、阿魏酸、苹果酸、油酸、邻苯二甲酸、棕榈酸和琥珀酸等，它们一方面可可引起根际周边的Eh和pH改变，促进土壤中难溶性磷化合物溶解。另一方面可与钙、铝、铁等金属元素形成螯合物，使根际土壤中难溶性的磷释放出来，从而显著提高根际土壤有效磷的浓度，达到自身调节和改善营养状况的目的（Zhong et al.，2019）。另外，还能与土壤中的重金属离子发生反应，形成毒性较小的化合物，减轻毒害离子对植物根系的毒害作用（Chen et al.，2016）。因而，根系分泌物中有机酸组分的研究对于根系分泌物功能的认识有着重要现实意义。

内蒙古短花针茅荒漠草原生态系统，植物群落中个体在竞争中通过相互作用、相互适应、相互选择形成了与环境资源相适应的地带性植被。植被草层低矮、稀疏，种类组成贫乏，由20多种植物种组成。群落建群种为短花针茅（Stipa breviflora），优势种为无芒隐子草（Cleistogenes songorica）和冷蒿（Artemisia frigida），主要伴生种有阿氏旋花（Convolvulus ammannii）、阿尔泰狗娃花（Hetropappus altaicus）和木地肤（Kochia scoparia）等（李勤奋，2001）。目前，有关短花针茅荒漠草原生态系统的研究主要集中在地上部分，而地下部分制约草原生态系统研究的理论有待拓展。较少的研究也只是局限于土壤最为基本的理化性质方面（Akiyama et al.，2007），而植物根系分泌物的相关研究更为缺乏。本研究以内蒙古四子王旗荒漠草原群落不同生态位的5种主要植物为研究对象，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法（UPLC-QTof/MS）分析其根分泌物中的有机酸组分，并采用化学模拟的方法研究了4种有机酸组分对荒漠草原原位土壤中微生物数量及土壤主要养分的影响，以了解荒漠草原植物根分泌物组分的生态学功能。

1 实验材料与方法

1.1 研究区概况

研究样地位于内蒙古农业科学院四子王旗实验基地，地处 41°47′18″N，111°53′45″E。该区常年多风、少雨雪，昼夜温差大，年均降水 280—300 mm，年均气温约3.4 ℃，无霜期90—120 d。实验地属典型的荒漠草原，草地植被低矮，植被覆盖率不足30%，植物物种组成简单贫乏。草地建群种为短花针茅（Stipa breviflora），优势种为无芒隐子草（Cleistogenes songorica）和冷蒿（Artemisia frigida），主要伴生种有银灰旋花（Convolvulus ammannii）、阿尔泰狗娃花(Heteropappus altaicus）、栉叶蒿（Neopallasia Pectinata）、野韭（Allium ramosim）等。土壤类型为淡栗钙土，pH值为8.4—8.8，土层厚度约1 m，砂粒所占比例最大，粉粒和粘粒次之，土壤具有缺氮、少磷、富钾、肥力低等特点（王忠武，2009）。

1.2 植物根系及土壤样品的采集

于2018年8月在实验地的围封区内，挖取长势良好的短花针茅、冷蒿、无芒隐子草、阿尔泰狗娃花和银灰旋花各10丛，同时在草原空地用土钻钻取0—20 cm草地原位土壤。将植株连同土壤（尽可能保持植物根系完整）一起带回实验室将植物根系小心清洗干净。土壤样品风干后过 1 mm土壤筛，用于回接根分泌物组分模拟物的室内培养实验。

1.3 根系分泌物的水培提取

将洗净的5种植物定植于霍氏（Hoagland）营养液复性5 d，每天更换营养液一次，同时用增氧泵通气。复性后的根系放入1% NaClO浸泡20 min，用无菌水冲洗干净后定植于500 mL烧杯中，加无菌水至植物根部全部被浸没。烧杯遮光处理，于室温（25—28 ℃）条件下分别培养12 h后将根系取出，烧杯内液体即为收集12 h的根分泌物收集液。然后加等量水，将根系同上再放入烧杯中，培养24 h和48 h后，分别收集24 h和48 h的根分泌物原液。将上述收集液过滤后，用旋转蒸发仪（HB-10）浓缩10倍。取1 mL浓缩液加3 mL甲醇混匀、离心，取上清液 1 mL过 0.22 μm 滤膜后待检（Staniforth et al.，1999；高雪峰等，2019）。

1.4 根分泌物组分的鉴定

采用美国 Watres公司的 ACQUITY UPLCClass超高效液相色谱仪分析各样品中的根分泌物有机酸组分。色谱条件为：ACQUITY UPLC C18BEN色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）。流动相：0.1%甲酸水 (A)—0.1%甲酸乙腈（B）；梯度洗脱（0—1 min，95% A；1.1—5 min，80%—25% A；5—12 min，25%—8% A；12—12.1 min，8% A；12.1—17 min，0% A；17.1—21 min，95%A）。样品室温度：10 ℃；柱温：40 ℃。体积流量：0.4 mL·min-1；进样量1 μL。质谱条件：ESI负离子检测方法；干燥气温度400 ℃，体积流量100 L·h-1；毛细管电压2.5 kV；碎裂电压80 V；锥孔电压40 V。扫描方式：MS全扫描。质量范围：100—1500 Da。

1.5 土壤处理

以植物根系分泌物中常见的7种有机酸组分柠檬酸、阿魏酸、苹果酸、油酸、邻苯二甲酸、棕榈酸和琥珀酸为标准样品。经UPLC-QTof/MS法分析表明，在波长210 nm检测时，标准样品中的7种有机酸分离效果均较好。依据5种植物根分泌物的UPLC检测结果，购置了4种有机酸棕榈酸、油酸、邻苯二甲酸和琥珀酸（Sigma公司，分析纯）。将固态的棕榈酸和琥珀酸溶于甲醇溶液配制成饱和溶液原液，分别取4种有机酸原液0、0.5、1、1.5 mL于1000 mL的玻璃瓶，各玻璃瓶加无菌水5 mL并摇晃使其分散，然后加风干土100 g，用玻璃棒搅匀后加盖密封。实验共设13个处理，分别为棕榈酸 3 种质量浓度处理 LZ（5 μL·g-1）、MZ（10 μL·g-1）和 HZ（15 μL·g-1），油酸 3种质量浓度处理 LO（5 μL·g-1）、MO（10 μL·g-1）和 HO（15 μL·g-1），邻苯二甲酸 3种质量浓度处理 LP（5 μL·g-1）、MP（10 μL·g-1）和 HP（15 μL·g-1）与琥珀酸 3 种质量浓度处理 LS（5 μL·g-1）、MS（10 μL·g-1）和 HS（15 μL·g-1）。对照 CK 质量浓度为 0 μL·g-1。每一处理设3重复，共39个处理。将玻璃瓶置于25 ℃恒温箱中培养3周。浓度的设置依据根系分泌物的实际浓度并参考了曲晓华等（2015）的方法确定。

1.6 土壤微生物及养分分析

细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌采用马丁氏琼脂培养基，放线菌采用高氏Ⅰ号培养基（周德庆等，2013）。土壤有机碳（SOC）采用重铬酸钾容量法测定，速效氮（AN）采用碱解扩散法测定，速效磷（AP）采用0.5 mol·L-1NaHCO3法测定，含水量采用烘干法测定，土壤 pH值采用酸度计（FE28-Standard）测定（鲍士旦，2013）。各处理均设3重复。

1.7 数据处理与分析

采用 SPSS 18.0单因素方差分析（One-way ANOVA）法对各处理土样中的微生物数量及土壤性状进行差异显著性分析，利用Canoco 4.5软件对微生物数量与土壤养分间的相关性进行冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）分析并制图（李婷婷等，2015）。

2 结果与分析

2.1 5种植物根分泌物中有机酸组分分析

内蒙古荒漠草原建群种短花针茅，优势种冷蒿和无芒隐子草以及伴生种银灰旋花和阿尔泰狗娃花根分泌物中有机酸组分的 UPLC-QTof/MS检测结果见表1。

由表1可知，5种植物共检测到棕榈酸、油酸、邻苯二甲酸和琥珀酸4种有机酸分泌物。其中，短花针茅根分泌物中检出目标有机酸为棕榈酸和油酸2种，收集12、24、48 h 3个时间段的棕榈酸相对含量均高于油酸。无芒隐子草根分泌物中检出棕榈酸、油酸和邻苯二甲酸3种有机酸。3个不同时间段均为棕榈酸相对含量最高，油酸次之，邻苯二甲酸最低。冷蒿根分泌物中只有收集12 h的样品中检测到邻苯二甲酸，而且相对含量极低，仅有0.001%。银灰旋花根分泌物中共检到棕榈酸、油酸、邻苯二甲酸和琥珀酸4种有机酸，3个不同时间段4种有机酸的相对含量排序为棕榈酸＞油酸＞邻苯二甲酸＞琥珀酸。阿尔泰狗娃花根分泌物中共检测到棕榈酸和油酸2种有机酸，3个不同时间段的棕榈酸相对含量均高于油酸。总体来看，5种植物根分泌物中有机酸含较低，有机酸组成相似但不完全相同。除冷蒿外，其余4种植物根分泌物中均含有棕榈酸和油酸，而且均为棕榈酸的含量（0.490%—0.671%）高于油酸含量（0.047%—0.069%）。冷蒿、无芒隐子草和银灰旋花根分泌物中均含有邻苯二甲酸，但含量很低，仅为 0.001%—0.007%。银灰旋花根系分泌物中的有机酸种类最多，除棕榈酸、油酸、邻苯二甲酸外，还有琥珀酸（0.002%）。

2.2 有机酸分泌物组分对草原土壤微生物的影响

不同浓度的棕榈酸（LZ、MZ、HZ）、油酸（LO、MO、HO）、邻苯二甲酸（LP、MP、HP）和琥珀酸（LS、MS、HS）对土壤中细菌、真菌、放线菌和微生物总数的影响分析结果见表2。

由表2可看出，对照CK土壤中，三大类群可培养的微生物中，细菌数量最多，放线菌次之，真菌含量最低。细菌数量是放线菌的2倍左右，是真菌数量的近50倍。可见，细菌仍然是内蒙古荒漠草原土壤中微生物的主体。表2表明，不同浓度的4种有机酸分泌物组分对土壤微生物的影响不完全相同。其中，与CK相比，不同浓度的棕榈酸和油酸均可使土壤中的细菌、真菌和放线菌三大类群微生物数以及微生物总数显著增加（P＜0.05），而且浓度越大，增加越显著。不同质量浓度的邻苯二甲酸对放线菌无显著影响，低质量浓度（5 μL·g-1）时对细菌、真菌以及微生物总数也无显著影响，而在中（10 μL·g-1）、高质量浓度（15 μL·g-1）时，对细菌有抑制作用，而对真菌有促进作用。琥珀酸在质量浓度为5—15 μL·g-1范围内，低浓度时对细菌和真菌有显著促进作用，对放线菌和微生物总数无显著影响，中浓度时对细菌和微生物总量无显著影响，却可以显著地促进真菌和放线菌的增加，高浓度时对细菌无显著影响，可以使土壤真菌数量显著增加，放线菌数量显著降低，使微生物总数显著降低。

表1 根分泌物中有机酸及其含量Table 1 Relative content of organic acids in root exudates

表2 不同浓度的4种有机酸处理后土壤中微生物的数量Table 2 The number of microorganisms in soil after treatment with four organic acids at different concentrations cfu·g-1

2.3 有机酸分泌物组分对草原土壤养分的影响

不同质量浓度的 4种有机酸对土壤有机碳（SOC）、速效氮（AN）、速效磷（AP）、土壤pH值和土壤含水量（SM）的影响见表3。

由表3可知，与CK相比，3种不同质量浓度的棕榈酸、油酸和琥珀酸的加入均可使土壤中的有机碳、速效氮和速效磷的含量显著增加（P＜0.05），而且均表现为浓度越大增加越显著。而邻苯二甲酸的加入可使土壤有效磷显著增加，却使土壤有机碳和速效氮显著降低。不同浓度的4种有机酸均可使土壤的pH值显著降低，而且有机酸的浓度越大，pH值降低越显著，但对土壤含水量均无显著影响。除邻苯二甲酸外，不同浓度的棕榈酸、油酸和琥珀酸的加入均使土壤有机碳含量显著增加。表明外源加入的有机酸物质在培养时间内均没有完全被土壤微生物转化利用而导致土壤有机碳含量较CK增加。而只有邻苯二甲酸的加入使土壤中有机碳含量显著降低，而且浓度越高降低越显著，原因可能是邻苯二甲酸的加入激发了土壤中原有有机碳的分解或者是邻苯二甲酸容易被微生物利用分解。对土壤速效氮而言，4种有机酸中，棕榈酸对土壤速效氮的促进作用最大，而邻苯二甲酸的加入导致土壤速效氮显著降低。4种有机酸都可显著提高土壤速效磷含量，而且效果相近。4种有机酸均可使土壤pH值下降，而且棕榈酸的效果最好。因此，相比较而言，棕榈酸使土壤中的有机碳、速效氮、速效磷的增加最为显著，而且使原本偏碱性的荒漠草原土壤pH值下降幅度也最大，是4种有机酸中对土壤的肥力状况改善效果最好的。

表3 不同质量浓度的4种有机酸处理后的土壤养分Table 3 The soil nutrients treated with four organic acids at different concentrations

2.4 微生物与土壤环境因子间的冗余分析

13个样本中土壤微生物与土壤理化因子之间的冗余（RDA）分析结果如图1所示。

图1 土壤微生物与环境因子的RDA分析Fig. 1 Redundancy analyses between soil microorganisms and physicochemical properties

由图1可知，第1轴和第2轴的累计贡献率为96.55%。第一轴能够解释所有变量的 90.80%，且与土壤有机碳、速效氮和pH值有显著的相关性。表明了有机碳、速效氮和pH值在水平方向影响了土壤微生物种群的分布。第二轴能解释所有变量的5.75%，速效磷与第二轴存在显著的相关性，表明土壤速效磷影响了垂直方向上土壤微生物群落的分异，并将不同样本区分开。总体上，土壤有机碳、速效氮、速效磷和pH值对土壤微生物数量影响均较大，而且这些因素对排序结果的贡献率相似（箭头长度相近）。在13个样本中，与对照CK距离较近的样本有LZ、LO、MO和LS，较远的样本包括 HZ、HP、MS和HS，表明了低浓度（5 μL·g-1）的棕榈酸、琥珀酸、油酸以及中浓度（10 μL·g-1）的油酸对土壤微生物的影响很难小，而高浓度（15 μL·g-1）的棕榈酸、邻苯二甲酸、琥珀酸以及中浓度（10 μL·g-1）的琥珀酸对土壤微生物的影响较大。进一步表明4种有机酸均随浓度增加对土壤三大类群微生物的影响越大。同时可看出，环境因子与土壤微生物间的关系为，土壤细菌、真菌放线菌和微生物总数与速效氮和有机碳均呈正相关关系，而与pH值呈负相关关系。

3 讨论

根分泌物的组成较为复杂，通常情况下，同种植物的根系分泌物组成有较高的相似性，不同植物的根系分泌物种类差别较大（何海斌等，2005；Paterson et al.，2007）。有机酸作为分泌物中起关键作用的一类物质，其组成和数量也与植物种类以有密切关系。如油菜根系分泌物中的有机酸主要组分为柠檬酸和苹果酸，而萝卜根系分泌物中的有机酸主要为酒石酸、丁二酸和苹果酸（涂书新等，2010）。小麦根分泌物的有机酸主要组分为棕榈酸（Pan et al.，2013；Xu et al.，2013）。不同种烟草根分泌物中的有机酸组分和含量不同，但含有共同组分甲酸，且甲酸含量显著高于其他有机酸（余浩等，2018）；蓖麻根分泌物中含有草酸、乙酸、丙酸、苹果酸、柠檬酸和乳酸6种有机酸（高媛媛等，2018）。伞莎草根分泌物在高浓度磷胁迫下含有邻苯二甲酸和间苯二羧酸（张建聪等，2019）。本研究采用 UPLC-QTof/MS对荒漠草原建群种短花针茅、优势种无芒隐子草和冷蒿以及主要伴生种银灰旋花和阿尔泰狗娃花的3个不同收集时间段的根分泌物分析结果表明，5种不同植物根分泌物中的有机酸组成及其含量虽然不完全相同，但也有一定的相似性。其中4种植物（冷蒿除外）根分泌物中均含有棕榈酸和油酸2种共同组分，而且棕榈酸是该4种植物的主要有机酸组分。同时，每种植物的 3个收集时间段（12、24、48 h）分泌物组分和含量差异均不大。暗示了在相同生长环境中的不同类群植物的根分泌物有一定程度的相似性，这些共有的分泌物极可能有利于他们适应其生存环境。正如目前研究认为，根系分泌物的产生是植物根部长期进化的结果，是植物体适应环境的一种体现，不是一个完全被动的过程。因为植物的任何代谢功能都会直接或间接地消耗碳源和能量（吴林坤等，2015；Kateryna et al.，2018）。

根系分泌物作为植物与根际微生物相互作用的媒介，其不仅为根际微生物提供碳源和能源，而且不同植物根系分泌物的种类和数量也影响根际微生物群落的组成、数量及活性（吴彩霞等，2009；王明霞等，2012）。棉花根系分泌物对棉田土壤微生物影响的研究表明,中、高浓度棉花根系分泌物能显著增加土壤中细菌的数量，而不同浓度处理的土壤对放线菌数量的影响不显著（周慧杰，2013）。一定浓度的花生根系分泌物能够明显改变土壤微生物学特性及群落功能多样性（黄玉茜等，2015）。入侵植物假高粱根系分泌物对入侵地土壤微生物种群的影响具有选择性，对部分细菌类群有显著促进作用，而对部分细菌类群则显示抑制作用（刘纯等，2013）。本研究中荒漠草原植物的4种有机酸分泌物组分对土壤中三大类群微生物数量的影响分析显示，棕榈酸和油酸均可使细菌、真菌、放线菌以及微生物总数均能显著增加。邻苯二甲酸对细菌和微生物总数有抑制作用，而对真菌有促进作用。琥珀酸对细菌和真菌有促进作用，对放线菌的影响表现为低促高抑的浓度效应。表明了根系分泌物不同组分对根际土壤微生物的影响并不完全相同，而根系分泌的主要组分（棕榈酸和油酸）对三大类微生物都有促进作用，可提高荒漠草原植物根际土壤微生物的活性。揭示了植物根系在分泌过程中具有主动调控分泌物组分能力，是植物适应其生存环境的一种生理调节机制。

根系分泌物不仅影响根际土壤中微生物群落组成，而且还可以改变根际土壤的理化特性（赵小亮等，2009）。根系分泌物可通过改变根际土壤pH值、氧化还原条件或通过螯合作用增加某些养分的溶解度和移动性，进而促进植物对养分的吸收（徐文静等，2014）。根系分泌物组分模拟物对土壤钾素活化效果显著（何冰等，2015）。本研究中4种有机酸组分的3种浓度处理均可降低荒漠草原土壤的pH值，同时提高了土壤速效氮和速效磷的含量，对土壤理化性状有改善作用，而且棕榈酸的效果最好。有研究表明，外源添加棕榈酸能促进黄瓜、番茄和西瓜的生长（Liu et al.，2008；Chu et al.，2014），外源添加邻苯二甲酸对胡萝卜种子萌发、幼苗叶片渗透的影响表现为低促高抑的浓度效应（杨延杰等，2013）。表明了植物根分泌物中的有机酸组分可以改善根际土壤微环境，进而促进植物的生长。另外，结合RDA分析表明，植物有机酸分泌物组分进入土壤后，首先降低了根际土壤的pH值，进而导致土壤中微生物类群的变化，在微生物组成及活性的变化与pH值变化的综合作用下，改变了土壤中的物质转化与循环，促进了土壤速效养分的活化，有利于植物对养分的吸收与利用，进而促进了植物的生长。

4 结论

内蒙古短花针茅荒漠草原的短花针茅和阿尔泰狗娃花根分泌物均检测到棕榈酸和油酸。无芒隐子草根分泌物共检测到棕榈酸、油酸和邻苯二甲酸3种有机酸组分。冷蒿根分泌物中只检测到邻苯二甲酸1种有机酸组分。银灰旋花根分泌物中共检测到棕榈酸、油酸、邻苯二甲酸和琥珀酸4种有机酸组分。4种有机酸分泌物组分均对根际土壤细菌、真菌、放线菌以及土壤pH值及有效养分有显著的影响，特别是分泌物中含量较高的棕榈酸和油酸，能够显著提高土壤微生物活性和活化土壤速效养分，能够改善荒漠草原植物根际土壤微环境。