汤茜，丁访军，朱四喜*，吴鹏，崔迎春，赵文君，侯贻菊

1. 贵州民族大学生态环境工程学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省林业科学研究院，贵州 贵阳 550005

土壤是陆地生态系统中植物生长的基础（黄先飞等，2018）。土壤酶作为土壤生物指标，可指示土壤肥力和质量的敏感度（刘莎等，2012；方瑛等，2016；罗琰等，2017；李艳红等，2020）。土壤水解酶主要是具有高度催化作用的蛋白质，对土壤中物质循环和能量流动、有机质分解和腐殖质合成十分重要（刘烁等，2018）。土壤酶活性具有显著的空间差异，其变化直接影响物质循环速率，与土壤化学性质、土壤养分、植物群落结构有密切的关系（金裕华等，2011；杨瑞等，2016）。土壤中纤维二糖水解酶（CBH）、β-葡糖苷酶（BG）、β-N-乙酰氨基葡萄糖酶（NAG）等在一定程度上反映了土壤生态系统碳、氮、磷等生物地化循环过程与动态特征，而亮氨酸氨基肽酶（LAP）与土壤蛋白质水解有关，β-1, 4-木糖苷酶（BX）能将纤维素、木聚糖等土壤糖类充分水解，供给微生物碳源，促进碳循环，是体现土壤生态过程的几种关键酶类（边雪廉等，2015；Lei et al.，2017）。因此，通过对土壤酶分布、变化以及酶活性影响因素的研究，可以预测土壤肥力状况的空间分布，有利于合理利用土壤资源，对植物和土壤质量可持续发展具有重要意义。

目前，中国学者针对喀斯特地区土壤等已经开展了一定研究（宫杰芳等，2018；刘烁等，2018），但对喀斯特地区不同演替阶段下土壤酶活性的研究较少。喀斯特地区土壤浅薄不连续，各生境间土壤异质性大，对土壤生长分布以及土壤环境的空间分布等都有着较大影响（蒲通达，2015）。茂兰喀斯特原始森林位于贵州省荔波县境内，是目前世界上同纬度地区喀斯特原生性森林分布面积最大的地区，该地区现仍保持较高的自然森林生态系统特征，在整个西南喀斯特地区具有较好的代表性（刘红霞等，2016）。因此，本文以贵州茂兰喀斯特地区下不同演替阶段土壤作为研究对象，研究其不同演替对土壤酶活性变化的影响因素，为茂兰喀斯特森林保护和发展提供土壤学理论帮助。

1 材料与方法

1.1 样品采集

本研究分别选择茂兰喀斯特地区内4个不同演替阶段作为土壤采样点（表 1），分别为：原生林阶段（Primary forest stage，P）、次生林阶段（Secondary forest stage，SE）、灌木林阶段（Shrub stage，S）、草本阶段（Herbaceous stage，H）。在2019年5月6日，土壤取样按不同演替阶段在样地内进行，每个阶段中分别选择3个相似样地，每个样地设置具有代表性不同大小样方，原生林和次生林阶段为30 m×30 m，灌木林阶段为20 m×20 m，草本阶段为10 m×10 m，一共12个样地。每个样地分别在石沟（SG）、石缝（SF）和土面（TM）3种小生境内采集土样，为探索茂兰喀斯特土壤酶在垂直水平上的特点，对土壤进行分层（0—10、10—20 cm）采集。考虑其土壤异质性，每个样地中3种小生境均只选择1个样点，每个阶段采集18个土样，共计 72个样品。将每个土样剔除石头和动植物残渣后混匀，分两份装入样品袋并各自标记清楚，一份用于风干后测定土壤化学性质，另一份冷藏用于土壤酶活性分析。

表1 不同植被演替阶段基本信息Table 1 Basic information of vegetation at different vegetation types

1.2 土壤化学性质测定方法

本研究共测定土壤pH值、土壤铵态氮、土壤硝态氮、土壤全氮（TN）、土壤全磷（TP）、土壤有效磷、土壤有机质（SOC）等土壤化学性质。根据《土壤农业化学分析方法》（鲁如坤，2002），土壤pH用酸碱度计测定水土比为2.5∶1，土壤铵态氮采用水杨酸钠法、土壤硝态氮采用硫酸肼还原法、土壤全氮采用硫酸消煮-水杨酸钠法、土壤全磷采用硫酸消煮-钼锑抗法、土壤有效磷采用磷钼蓝分光光度法、土壤有机质采用重铬酸钾容量法（硫酸外加热法）测定（鲍士旦，2000）。

1.3 土壤水解酶及其酶活性测定方法

本研究选择并测定BG、BX、CBH、NAG、LAP 5种土壤水解酶，水解酶详细情况见表 2。分别设置反应孔、无机质对照、底物以及空白对照孔，设置4个重复，将土样震荡液与缓冲液按不同比例添加至96位黑色酶标板中，在37 ℃或25 ℃下的温度下培养4 h后，使用多功能酶标仪（SynergyH1，BioTek）进行荧光测定，在365 nm波长处激发，在 450 nm 处检测荧光。酶活性单位为 μmol·h-1·g-1。

1.4 数据处理

原始数据基本整理采用Excel软件，采用SPSS 21.0软件的Pearson相关系数法进行相关性分析，差异性分析使用 SAS软件进行单因素方差分析（One ANOVN），采用Origin 9.1软件作图。显著性水平α=0.05，且表中数据表现形式为：均值±标准误。

2 结果与分析

2.1 不同演替阶段对土壤化学性质的影响

在原生林阶段、次生林阶段、灌木林阶段和草本阶段4个演替阶段中，土壤 pH、有效磷和硝态氮差异不显著（表 3）。原生林阶段土壤有机质和全氮显著高于其他演替阶段，其次有机质含量为灌木林＞次生林＞草本阶段。原生林、次生林和灌木林阶段土壤全磷含量差异不显著，其中灌木林最高，草本阶段最低，仅占灌木林阶段的44.2%，占原生林和次生林的54.8%。草本阶段土壤碳氮比（C/N）值显著高于其他3个演替阶段，且3个演替之间C/N差异不显著。除pH、有效磷、C/N外，其他化学因子皆表现为草本阶段含量低于其他3个演替。

对不同小生境与化学因子进行分析（表4），4个演替阶段中pH、有机质、有效磷、全氮、全磷、铵态氮、硝态氮和C/N在小生境中普遍表现为石缝最高。有效磷、全氮、全磷含量在除灌木林阶段外的另3种演替中表现为石沟小生境最低，在灌木林阶段中表现为在土面中最低。土壤 pH、有效磷、全氮、硝态氮和C/N在4种演替的不同生境中不存在显著差异。在原生林、次生林和灌木林3种演替阶段中，不同演替间土面内有机质、全磷含量无显著性差异，而3种生境中有机质、全磷与草本阶段小生境存在显著性差异。在灌木林阶段，铵态氮在3种小生境中无显著差异，原生林石沟铵态氮浓度显著高于另外3种演替，灌木林阶段石沟中铵态氮占原生林阶段石沟的47.1%，次生林阶段占48.7%，而草本阶段中仅占22.5%。

表2 水解酶名称、底物、缩写及功能简介Table 2 Brief introduction of hydrolase and their corresponding substrates, abbreviation and functions

表3 不同植被演替阶段土壤化学因子Table 3 Soil chemical factors at different vegetative succession stages

表4 不同植被演替阶段不同小生境的土壤化学因子Table 4 Soil chemical factors of different microhabitats in different vegetation succession stages

从表 5可知，土壤 pH、有效磷、全磷和硝态氮在各演替阶段不同土层之间无显著差异，有机质、全氮和铵态氮在各演替阶段不同土层之间均存在显著差异，土壤C/N在原生林和次生林阶段表层土和下层土之间无显著差异，在灌木林和草本阶段不同土层之间存在显著差异。土壤有机质、有效磷、全氮、全磷、铵态氮表现为土壤表层＞土壤下层，而土壤pH、硝态氮和C/N反之。

从表层土来看（表 5），土壤 pH和硝态氮在不同演替阶段之间无显著差异，有效磷、全磷在 4种演替中差异显著性低于有机质、全氮、铵态氮和C/N；除土壤pH、有效磷和C/N外，其他化学因子量均为草本阶段最低，原生林阶段最高，下层土亦是。下层土中，土壤pH和硝态氮表现与上层土相同；有机质、全氮、铵态氮、硝态氮在原生林阶段最高；有机质、全氮、全磷、铵态氮和C/N在4种演替中存在差异较为显著。

2.2 不同演替阶段对土壤酶活性的影响

图1 不同植被演替阶段土壤酶活性Fig. 1 Soil enzyme activity at different vegetative succession stages

表5 不同植被演替阶段不同土层的土壤化学因子Table 5 Soil chemical factors of different soil layers at different vegetation succession stages

由图1可见，各演替阶段下亮氨酸氨基肽酶活性远高于BG、BX、CBH和NAG，其次是BG＞NAG＞BX＞CBH。在不同演替阶段土壤酶活性中，LAP、BG、BX、CBH和NAG均表现为S＞SE＞P＞H。

在各演替阶段中5种水解酶含量均为灌木林阶段最高，次生林阶段次之，其次是原生林阶段和草本阶段（图2）。在不同演替阶段3种小生境中，LAP、BG、BX和CBH均表现为石缝中活性最高，NAG则为在次生林和灌木阶段为土面中活性最高，在原生石缝中活性较高，在草本阶段为石沟中活性最高。

由图3见，分别在土壤表层和土壤下层，不同演替阶段土壤水解酶LAP、BG、BX、CBH和NAG均表现灌木林阶段＞次生林阶段＞原生林阶段＞草本阶段。而在不同演替阶段，LAP、BG、BX、CBH、NAG活性均表现为土壤表层大于土壤下层。

2.3 不同演替阶段土壤酶活性与化学因子的相关性

图2 不同植被演替阶段不同小生境的土壤酶活性Fig. 2 Soil enzyme activity of different microhabitats in different vegetation succession stages

图3 不同植被演替阶段表层土与下层土的土壤酶活性Fig. 3 Soil enzyme activity of topsoil and subsoil in different vegetation succession stages

对4种不同演替阶段的化学因子与土壤酶活性进行Pearson相关系数分析，由表6可看出，在原生林阶段，CBH与 BG之间显著正相关，全磷与BG和CBH呈显著负相关。次生林阶段，BX与CBH呈显著正相关，与 C/N呈显著负相关，而 BG与NAG为显著正相关。灌木林阶段，BX与CBH呈显著正相关。从整体上看，土壤水解酶受土壤化学因子影响较小，各演替阶段土壤酶与土壤化学因子之间均无显著相关性。

3 讨论

3.1 不同演替阶段土壤化学性质的变化

土壤是为植物生长发育提供能量的物质基础，对植物群落的分布和生长有重要影响，同时植物群落类型和生长也能够反过来影响土壤化学性质（岳琳艳等，2015；宋翰林，2018）。土壤肥力随演替进展呈增加趋势，有促进群落演替的作用（张庆费等，1999）。土壤pH与土壤有机质的分解和养分等的转化迁移等都有关（耿玉清，2006）。在本研究中，随着演替进程，土壤有机质、全氮、全磷、铵态氮、硝态氮呈上升趋势，土壤肥力增加，而土壤pH呈下降趋势，这是由于群落在演替至顶级群落的过程中，森林形成多层次垂直结构，群落自肥能力加强；同时，pH越低，土壤氮素损失就越多，所以铵态氮含量与pH变化呈反比，这与王琳琳等（2008）的研究结果相同。而铵态氮含量大于硝态氮含量，可能是由于pH抑制了硝化细菌生长，硝化作用受到抑制（孟盈等，2001）。土壤磷含量在演替进程中会呈现增加趋势，但增速缓慢（阎恩荣等，2008），这与本研究中结果一致。有效磷和全磷含量虽然随演替进程而呈增加趋势，但在各演替阶段无显著差异，这与刘瑞强（2019）的研究结果相同。本研究中土壤C/N随演替进程呈下降趋势，且与土壤有机质含量呈反比，这是因为有机质的分解，有机质分解越快，C/N越低（张海鑫等，2018）。

表6 不同植被演替阶段土壤酶活性与土壤化学因子Pearson相关系数分析Table 6 Pearson correlation coefficient analysis of soil enzyme activity and soil chemical factors in different vegetation succession stages

由于喀斯特地区特殊的溶蚀环境和生境特点，土壤性质呈现极强异质性（Stoécio et al.，2009）。本研究中，已测土壤因子在小生境中普遍表现为石缝高于石沟和土面，这是由于石缝环境狭小，成土主要以岩石风化和腐殖化为主，更容易形成堆积物，雨水、潮湿和凋落物的堆积导致其有机质含量较大，而岩石风化则导致pH高于石沟和土面。在原生林、次生林和灌木林3种演替阶段中，土面之间有机质、全磷含量无显著性差异，而有机质、全磷分别在不同演替的不同小生境中均存在显著性差异，可能原因是受不同小生境环境以及地上不同植被的影响，说明土壤化学性质在不同演替不同生境下所受影响不同，也体现了喀斯特地区土壤性质的异质性。本研究中，各化学因子在草本阶段小生境中均表现最低且与其他演替阶段小生境存在显著差异，可能原因是草本阶段土壤浅薄、凋落物较少，植被少，土壤流失量远大于其他演替阶段（廖洪凯等，2013）。

有研究表明，喀斯特地区不同演替阶段中土壤养分含量均随土层深度的增加而减少（刘雯雯，2019），这与本研究结果一致。土壤pH、有效磷、全磷、硝态氮和C/N在各演替阶段不同土层之间无显著差异，而土壤有机质、全氮和铵态氮则存在显著差异，说明不同土层对土壤 pH、有效磷、全磷和硝态氮的影响小于土壤有机质、全氮和铵态氮，可能是因为枯枝落叶和腐殖质主要集中的土表，表层土中土壤养分含量较高，而随着土层深度的增加，腐殖层逐渐减少，植物根系和微生物等减少，导致土壤养分也随之减少（鲜娅等，2014）。除pH和C/N外，其他各化学性质在不同土层中仍表现为随演替进展而升高。

3.2 不同演替阶段土壤酶活性的变化

土壤酶活性对评价土壤质量、土壤肥力、生态环境效应以及土地利用和环境保护监测等方面都十分重要（杨宁等，2013；Ren et al.，2016；翟辉等，2016）。土壤酶系统与植物生长之间密切相关，而植被类型对土壤水解酶有重要影响。本研究中，5种土壤水解酶活性分别为 LAP＞BG＞NAG＞BX＞CBH，这与刘烁等（2018）的研究结果相同。在不同演替阶段中，LAP、BG、BX、CBH和NAG均表现为灌木林阶段＞次生林阶段＞原生林阶段＞草本阶段，可能原因是随着演替进展，森林郁闭度增加，原生林和次生林阶段因为林深树高，导致林内光照较低，且由于土壤采样时正值下雨，林内土壤湿度过高，导致土壤酶活性下降（刘捷豹等，2017），同时，光照和湿度等会影响土壤有机质或其他营养元素，进而对土壤酶活性产生影响。在孙双红等（2016）的研究中，土壤多酚氧化酶也随演替正向发展表现为活性降低。而在草本阶段，草地由于生产力低，凋落物少，从而导致土壤酶活性最低（刘烁等，2018）。

在Sinsabaugh et al.（2008）对酶的研究中发现，BG、CBH、LAP、NAG的活性均与土壤 pH显著相关，其中LAP随pH的增加而上升，而NAG活性与土壤pH呈负相关，Guan et al.（2014）的研究表明，BG、CBH、LAP和BX与土壤pH值呈正相关，这与本研究中结果一致。

在本研究中，LAP、BG、BX、CBH、NAG活性在4种演替阶段中均表现为土壤表层＞土壤下层，这与卢怡（2017）、蒋永梅等（2017）、蒲琴等（2016）的研究结果一致，主要原因为凋落物和腐殖质主要集中在土壤表层，所以土壤有机质含量高于土壤下层，透气性、温度、光照和湿度适宜时的土壤表层土壤酶活性较高，土层越深，土壤有机质含量越低，因此土壤酶活性降低。

3.3 不同演替阶段土壤酶活性与化学因子的关系

研究表明，影响土壤水解酶活性的因素很多，包括土壤养分（王笛等，2012）、植被类型（宋翰林，2018）、入侵植物（赵晓红等，2017）、海拔（樊金娟等，2016）和人为干扰等（曹慧等，2003）。本研究中，原生林阶段，全磷与BG和CBH呈显著负相关，这与Zheng et al.（2015）的研究结果一样，BG活性能够通过氮添加而显著激发，而添加磷则能够减弱这种激发，减低活性，这与其他演替阶段中全磷与BG和CBH之间的相关性不同，这可能是由于土壤环境因子异质性所导致。有研究表明，有机质与水解酶之间关系密切，有机质和土壤酶之间呈正相关关系，随着C/N的增加，有机质呈先增加后降低的趋势，因此，土壤C/N的变化对土壤中氮磷循环和土壤酶活性有着重要影响（窦晶鑫等，2009；隋跃宇等，2009；罗由林等，2015）。在李林海等（2012）的研究结果中，水解酶活性与有机质、全氮、全磷之间呈显著正相关，而与 pH 呈显著负相关，这与本研究中结果不太一致。在本研究中，随着演替进展，土壤pH和C/N的变化与土壤有机质、全氮、全磷、铵态氮、硝态氮相反，土壤全磷在不同演替阶段中无显著差异。在不同演替阶段的不同生境中，NAG活性与pH呈负相关，BG、CBH、LAP和BX与土壤pH值呈正相关，因此，土壤酶与pH之间的关系受生境环境的影响。而C/N与土壤酶之间，仅在次生林阶段，BX与C/N呈显著负相关，在其他不同演替阶段，不同酶与C/N之间的相关性不同，且各土壤水解酶与有机质、全氮、全磷、铵态氮、硝态氮之间的相关性也不尽相同。

4 结论

（1）随着演替阶段正向发展，在各演替阶段、各小生境和不同土层中，土壤有机质、有效磷、全氮、全磷、铵态氮、硝态氮均呈上升趋势，而土壤pH、碳氮比均呈下降趋势；在各小生境中，所有土壤化学因子普遍表现为石缝较高；而除土壤pH、硝态氮和C/N外，土壤养分含量在各演替和小生境中均随土层深度的增加而减少，表现为表层土＞下层土。

（2）在各演替阶段中，5种土壤水解酶活性均表现为：灌木林阶段＞次生林阶段＞原生林阶段＞草本阶段，而在水解酶之间表现为：LAP＞BG＞NAG＞BX＞CBH；在不同小生境中，LAP、BG、BX和CBH均表现为石缝中活性最高，NAG则是在次生林和灌木阶段土面中活性最高，在原生石缝中活性较高，在草本阶段为石沟中活性最高；LAP、CBH、NAG、BX、BG活性在4种植被类型中均表现为土壤表层＞土壤下层。

（3）喀斯特地区土壤酶活性的变化与演替阶段、土壤化学因子、土层深度和生境类型之间都存在影响，是多因素复合作用下的结果。因此，对茂兰喀斯特地区不同演替阶段土壤酶活性的影响研究还需要做进一步的探讨与分析，建议进行长期有效的观测，排除下雨、生长季与非生长季等因素，完善土壤酶和室内培养等有关实验，以望能更详细深入地说明土壤酶活性和各影响因素之间的关系，为维持茂兰喀斯特森林生态系统的健康稳定、建设管理和保护提供科学依据，为喀斯特地区土壤环境的整体研究提供部分参考。