高天歌 马翠敏 王锁民

摘要 液泡是细胞内一种可以储存多种营养物质以及代谢产物的细胞器。为了抵御高盐、干旱和重金属毒害等非生物胁迫，植物可以通过将细胞质中过量积累的Na+、K+、Ca2+和其他金属阳离子区域化至液泡中，以此来维持正常的细胞膨压并提高植物的抗逆性。液泡膜阳离子转运蛋白种类丰富，能够调控细胞中不同无机离子的转运和区域化。鉴于此，对定位于液泡膜的不同阳离子转运蛋白在植物响应逆境胁迫中的作用进行了简要概述。

关键词 液泡膜转运蛋白;阳离子;抗逆性;功能

中图分类号 Q945  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）21-0001-05

Abstract Vacuole is a kind of organelles that can store a variety of nutrients and metabolites in cells.In order to resist the harsh environments such as salinization， drought and heavy metal pollution， plants can change the turgor and improve its stress resistance by compartmentalizing the excess ions， such as Na+， K+， Ca2+ and other metal cations， in the cytoplasm into vacuoles.There are many tonoplastcation transporters regulated the transport and compartmentalization of different ions.In view of this， we mainly summarized the roles of different tonoplast cation transporters in plants responding to stresses in this review.

Key words Tonoplast transporters;Cation;Stress tolerance;Function

逆境胁迫是对植物生长发育造成不利影响的各种环境因素的总称，可分为生物胁迫和非生物胁迫[1]。其中，非生物胁迫是限制农作物产量和野生植物物种分布的主要因素，包括干旱、土壤盐渍化、低温、高温以及重金属毒害等[2]。在长期的进化过程中，植物形成了各种响应机制来抵御非生物胁迫，其中一种有效的应对策略是植物细胞通过将细胞质中过量的离子区域化至液泡中来维持其正常的膨压，从而提高植物的抗逆性[3-4]。在此过程中，定位于液泡膜上的负责调控胞内物质特异性识别和运输的转运蛋白发挥了重要的作用[5-6]。根据结构与作用机制的不同，大致将其分为3类：质子泵、通道蛋白以及共转运蛋白[7]。近年来，有关定位于液泡膜的各类阳离子共转运蛋白的结构和功能的研究受到了众多学者的广泛关注，且研究多集中于调控Na+、K+区域化的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（tonoplast Na+/H+antiporter，NHX）、调控Ca2+区域化的液泡膜Ca2+/H+反向转运蛋白（Ca2+/H+ exchanger，CAX）以及部分负责转运Cd2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+等金属阳离子的转运蛋白。鉴于此，笔者重点對上述几类液泡膜阳离子转运蛋白的结构及其在植物抗逆过程中的作用进行概述，以期为进一步研究植物的抗逆机理以及提高农作物和优良牧草的抗逆性提供借鉴。

1 植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（NHX）

钠（Na）是地壳中含量排名第六的元素，约占其总量的2.8%，同时也是海水中含量仅次于氯（Cl）的第二大元素[8]。Na在植物的生命活动过程中起到了重要作用，作为一种有益元素，其主要以Na+形式被吸收[9]。对于大多数植物而言，低浓度的Na+可以促进其生长，减轻植物由于营养不良而产生的症状，甚至适量的Na+还可以改善作物的品质与口感[10-11]。然而，在高盐条件下，土壤中过量的Na+则会导致大多数陆生植物的生命活动受到抑制，表现出中度甚至重度的Na+毒害症状[12]。而NHX作为一种重要的耐盐决定因子，可以介导细胞质中过多的Na+、K+区域化至液泡作为廉价的渗透调节物质，同时减少过量的Na+对细胞质中的代谢活动产生毒害作用[13]，从而在调节细胞渗透势与维持膨压，促进植株吸水以及提高植物耐盐、抗旱性等方面发挥十分重要的作用[14]。

1.1 NHX的结构

在高等植物中，最早是在红甜菜（Beta vulgaris）贮藏组织的液泡膜上检测到了Na+/H+转运活性[15]。之后，Gaxiola等[16]首次从拟南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆出了液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AtNHX1。自此，人们对于高等植物NHXs的研究也逐渐展开。目前，研究者分别从小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）、冰叶日中花（Mesembryanthemum crystallinum）、盐地碱蓬（Suaeda salsa）和霸王（Zygophyllum xanthoxylum）等植物中克隆得到NHX基因[17-21]。

研究表明，NHX是一种分子量为35 000～70 000 kDa的蛋白，一般其C末端由300多个氨基酸组成，且含有多个蛋白激酶作用位点，而N端则是由550多个氨基酸构成的10～12个跨膜区域（transmembrane domain，TM）[22]。通过分析AtNHX1的拓扑学结构，研究者发现AtNHX1共包含有12个跨膜域以及1个具有亲水性的C末端，且基本上都位于液泡腔中;而N末端则朝向胞质，同时在其第3个跨膜域上包含一个高度保守的氨氯吡嗪脒（amiloride）结合位点[23]。根据序列类型，NHX可分为两类，即Class-I NHX与Class-Ⅱ NHX;Class-Ⅱ NHX是在裸子、被子和苔藓植物中发现的，经证实其位于核内体上;而Class-I NHX则普遍存在于陆生植物的液泡膜上并具有特定的功能，拟南芥AtNHX1-AtNHX4就属于该亚型[24]。

1.2 NHX在植物抗逆过程中的作用

与野生型相比，过表达拟南芥AtNHX1的转基因番茄（Solanum lycopersicum）[25]和转基因油菜（Brassica napus）[26]的生长均未受到200 mmol/L NaCl处理的明显抑制。Zeng等[27]研究显示在水稻中过表达菊芋（Helianthus tuberosus）HtNHX1和HtNHX2能够提高转基因植株的抗盐能力。在盐处理下，与野生型相比，共表达霸王ZxNHX和ZxVP1-1（液泡膜H+-焦磷酸酶编码基因）的转基因紫花苜蓿（Medicago sativa）能够在叶片中积累更多的Na+、K+和Ca2+，以此来缓解盐胁迫对植物产生的不利影响[28]。以上研究表明，NHX1在植物响应盐胁迫的过程中起到了不可替代的作用，过表达NHX1可以在一定程度上提高植物的耐盐性[28-30]。除NHX1外，定位于液泡膜上的NHX2在植物抗逆过程中也发挥了关键的作用。在200 mmol/L NaCl的盐胁迫下，过表达小麦TaNHX2的转基因茄子（Solanum melongena）叶片的生长明显优于野生型，且其Na+、K+含量均较野生型显著增加，表明TaNHX2在转基因茄子耐盐性的响应过程中起着重要的调控作用，因此TaNHX2也可以作为改善作物耐盐性的候选基因之一[30]。杜梨（Pyrusbetulaefolia）PbrNHX2的表达水平受盐胁迫和脱水的诱导，但不受冷害的影响;在烟草（Nicotiana tabacum）中过表达PbrNHX2，发现其可通过调节活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平来增强转基因烟草抵御盐胁迫的能力[31]。此外，在正常条件下，定位于液泡膜的NHX3和NHX4对植物生长发育的影响虽然较NHX1和NHX2小，但是二者在离子转运方面仍具有自身的独特性，如AtNHX4对Na+、K+都具有转运能力且更偏向于转运K+，而AtNHX3则只转运Na+、不参与转运K+[32]。

除盐胁迫外，干旱也是严重影响植物生长发育的非生物胁迫之一[33]。霸王主要分布于我国西北荒漠地区，具有超强的抗旱性[34]。在干旱胁迫下，ZxNHX能够将细胞质中的Na+区域化至液泡，以降低細胞渗透势，从而使植物适应干旱环境[20]。研究表明，干旱处理下，共转化ZxNHX和ZxVP1-1的转基因紫花苜蓿的株高、根长和干重分别较野生型显著增加28.7%、67.7%和47.5%，且其叶片中的Na+、K+和Ca2+含量分别较野生型上升130.8%、81.7%和100.0%，表明共转化ZxNHX和ZxVP1-1可以显著提高植物的抗旱性[35]。在甜菜中过表达ZxNHX和ZxVP1-1可以使转基因植株地上部的Na+含量增加1.2～1.5倍，贮藏根中的蔗糖含量增加6%～16%，从而增加转基因甜菜对干旱的抵御能力[36]。除霸王外，有研究表明，在大麦（Hordeum vulgare）中过表达盐生草（Halogeton glomeratus）HgNHX1，不仅可以显著提高转基因大麦的耐盐性，还可以使其维持较高的水分代谢能力，具有更强的抗旱性[37]。

2 植物液泡膜Ca2+/H+反向转运蛋白（CAX）

钙（Ca）是维持植物生长发育所必需的大量元素之一，在植物生命进程中具有不可或缺的作用[38]。Ca2+不仅是细胞结构的组成成分和多种酶的辅助因子，而且还是细胞内重要的第二信使[39]。Ca2+可参与调控植物的生长发育，在其抗病和适应逆境的过程中具有重要作用，不仅如此，Ca2+还可以与钙调素（calmodulin，CaM）结合形成活化的Ca2+-CaM复合体，参与细胞内的信号转导[40-42]。植物体内的Ca2+通常处于动态平衡状态，Ca2+缺乏会导致叶片坏死，甚至引起植株的死亡;而Ca2+浓度过高则会造成离子毒害[43]。植物能够通过Ca2+转运系统调节其体内Ca2+的稳态平衡，其中液泡膜Ca2+/H+反向转运蛋白（CAX）能够将胞质中的Ca2+区域化至液泡内，从而对细胞内的Ca2+浓度起到调控作用[44]。

2.1 CAX的结构

CAX是由11个跨膜域组成的跨膜蛋白，其N末端位于胞质内，C末端则位于液泡中，并且N末端的亲水性区域可能会与激酶等信号蛋白相互作用以调节CAX发挥功能[44-45]。CAX的11个跨膜域可分为TM1、TM2-6和TM7-11共3个部分，其中TM1与阳离子的转运相关[46]。CAX具有4个功能域，分别为参与调控Ca2+/H+反向转运活性的N-末端自抑制区域（N-terminal regulatory region，NRR）[47-49]、决定Ca2+转运能力的Ca功能域（Ca2+ domain，CaD）[50]、与Mn2+的专一性相关的C功能域[51]、与细胞质pH调节相关的D功能域[52]。研究发现，拟南芥AtCAX1～AtCAX4均定位于细胞的液泡膜上[39]。

2.2 CAX在植物抗逆过程中的作用

许多研究表明，CAX在植物抵御非生物胁迫特别是盐胁迫的过程中发挥了重要的作用，CAX活性的改变会影响植物中由盐胁迫诱导的Ca2+信号的变化，进而影响植物对盐胁迫的耐受能力[53]。盐胁迫对CAX3的表达具有很强的诱导作用，但对CAX1表达的诱导则很微弱[39]。Zhao等[54]将拟南芥cax1和cax3单突株系以及cax1/cax3双突株系分别在含有50和100 mmol/L NaCl的介质中进行培养，发现cax3和cax1/cax3对盐具有较强的敏感性，而cax1则对盐的敏感性不明显;进一步的生化分析显示，cax3对盐的敏感性与盐胁迫下液泡膜Ca2+/H+转运活性以及质膜H+-ATPase活性密切相关，表明CAX3在植物响应盐胁迫的过程中发挥了重要的作用。此外，AtCAX1和AtCAX3可以协同发挥作用，二者的共表达能够显著提高Ca2+敏感型酵母K667的耐盐性[55]。除了AtCAXs，盐地碱蓬等其他植物的CAXs对于抵御盐胁迫也具有一定的作用，例如在拟南芥中超表达盐地碱蓬SsCAX1同样能够增强转基因植株对盐胁迫的耐受性[56]。此外，拟南芥AtCAX2、AtCAX4以及一些其他植物的CAXs还能参与调控除Ca2+外的其他金属阳离子的转运。

CAX在植物響应冷胁迫的过程中也发挥了重要的作用。cax1-1、cax1-2、cax1-3和cax1-4分别是4个AtCAX1的T-DNA插入突变株系，其中cax1-3和cax1-4在经过低温驯化后，其在不同低温处理下的存活率均显著高于野生型，表明AtCAX1能够参与调控拟南芥对低温的响应[57]。

3 其他阳离子液泡膜转运蛋白

锰（Mn）、锌（Zn）、铁（Fe）是植物生长发育所必需的3种微量元素，然而当细胞内这些金属离子的含量超过一定范围后也会对植物造成不可避免的伤害[58]。另外，镉（Cd）作为最常见的重金属之一，具有易被植物吸收的特点，并且过高浓度的Cd2+会对植物的生长发育造成损伤[59]。有研究表明，液泡膜上存在多种能够参与金属离子转运和区域化的转运蛋白，均可以起到缓解上述金属离子毒害以及维持植物生长发育的作用[60]，主要包括CAX家族转运蛋白、阳离子扩散辅助蛋白（cation diffusion facilitator，CDF）、自然抵抗相关巨噬细胞蛋白（natural resistance-associated macrophage protein，NRAMP）以及植物锌铁转运蛋白（zinc-regulated transporters，iron regulated transporter-like proteins，ZIP）等[61-62]。

3.1 转运其他金属离子的CAX

CAX不仅在植物Ca2+的转运中发挥重要作用，而且对植物抵御Cd2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+和Ba2+等金属离子毒害来说也是必不可少的。Shigaki等[52]研究发现拟南芥CAX1的一种突变体CAXcd，其可以将Cd2+区域化在酵母液泡内。Wu等[63]将CAXcd在矮牵牛（Petunia hybrida）中进行超表达，在50和100 μmol/L CdCl2处理36 d后，表达CAXcd的矮牵牛植株的长势明显好于野生型，且其能够在体内积累更多的Cd2+;同时研究还发现过表达CAXcd的矮牵牛植株从开花到种子成熟，植株的形态和生长发育并未受到其体内大量积累的Cd2+的明显影响。而在烟草（Nicotiana tabacum）中超表达AtCAX2还可以增加Mn2+在液泡中的积累[64]。Koren′kov等[65-66]研究发现AtCAX2和AtCAX4均可以将转基因烟草细胞质中的Cd2+、Zn2+和Mn2+区域化到液泡中，以缓解上述金属离子对植物造成的毒害。此外，研究发现CAX还可以参与细胞质中Ni2+和Ba2+的转运。庭荠属植物Alyssum lesbiacum的AlCAX 定位于液泡膜上，可参与Ni2+的转运与区域化，进而改变A. lesbiacum对Ni2+的耐受性[67]。而Liu等[68]将小花碱茅（Puccinellia tenuiflora）的PutCAX1在Ca2+敏感型酵母K667中进行超表达，可使酵母对Ba2+有一定的耐受能力。

3.2 CDF家族转运蛋白

CDF转运蛋白主要负责调控金属阳离子从胞质到胞外或细胞器的转运[62]，该家族蛋白按照系统进化关系可以分为3类，即Zn-CDFs、Fe/Zn-CDFs和Mn-CDFs转运蛋白[6]。目前，研究者已鉴定出许多CDF家族蛋白，通过生物信息学分析发现，该家族蛋白普遍具有6个跨膜域，在N端的第1和第2个跨膜域之间存在一个高度保守的特征序列，在C末端则存在一个特殊的阳离子外排结构域[69]。金属耐受性蛋白（metal tolerance proteins，MTP）是CDFs家族成员之一，研究表明，拟南芥AtMTP定位在液泡膜上，主要调控胞质中的Zn2+向液泡的区域化[70-71]。此外，水稻的OsMTP8.1和OsMTP8.2都是定位于液泡膜的阳离子转运蛋白，在高Mn2+条件下，OsMTP8.1缺失会导致水稻叶绿素含量下降，生长受限，证明OsMTP8.1是Mn2+特异性转运蛋白;而且OsMTP8.1还可以与OsMTP8.2协同发挥作用，将过量Mn2+区域化在水稻根系和幼苗的液泡中，以减少高Mn2+胁迫对水稻产生的毒害[72-73]。

3.3 NRAMP家族转运蛋白

NRAMP同样是一类重要的金属离子转运蛋白，能够参与多种二价金属离子的吸收和转运[6]。生物信息学分析显示，NRAMP蛋白普遍由12个跨膜结构域组成，其中第1～10个跨膜域具有疏水性，并且在第8和第9个跨膜域上还存在一个高度保守的“共有转运标签”序列基元，推测这段高度保守的序列可能与NRAMP蛋白的功能密切相关[74]。目前已在拟南芥和东南景天（Sedum alfredii）等植物中鉴定出了NRAMP转运蛋白，研究发现SaNRAMP3定位于液泡膜上，对Cd2+、Mn2+、Fe2+等都具有转运功能[75]。在拟南芥中，AtNRAMP3和AtNRAMP4同样定位于液泡膜，主要调控Mn2+和Fe2+的转运;AtNRAMP3和AtNRAMP4可以将液泡中的Mn2+运输至叶肉细胞的叶绿体中，且二者之间存在功能冗余[76];此外，AtNramp3 AtNramp4缺失突变株系还会因Fe2+缺乏而表现出白化以及种子不能萌发等现象[77]。

3.4 ZIP家族转运蛋白

ZIP是一类多次跨膜转运蛋白，能够吸收和运输二价金属离子，在维持植物体内Zn2+、Fe2+平衡的过程中起重要作用[78]。ZIP家族转运蛋白由326～425个氨基酸组成，普遍含有6～9个跨膜域：其中N末端位于细胞内侧，包含3～4个跨膜域，而C末端则位于细胞外侧，包含3～5个跨膜域;此外，在第3和第4个跨膜域之间还存在一个富含组氨酸残基的可变区，推测该区域可能与其能够参与调控金属离子的转运有关[79]。ZIP蛋白具有较多的疏水基团，有利于其与膜的结合，而这些结合在膜上的蛋白可以参与调控Zn2+、Fe2+的跨膜转运[80]。有研究发现，拟南芥AtZIP1定位于液泡膜，主要负责调控液泡Zn2+的外排，也可能参与根中Zn2+从液泡释放到细胞质的再活化过程[81]。在木薯（Manihot esculenta）中共表达拟南芥AtMTP1和AtZIP1能够显著提高贮藏根可食用部分的Zn2+含量，但是Zn2+的过量积累也会导致转基因植株矮小和叶片失绿等不良表型[82]。

4 總结与展望

干旱、土壤盐渍化以及金属离子毒害等非生物胁迫严重影响了我国农牧业的发展和生态环境的恢复。植物细胞中定位于液泡膜上的阳离子转运蛋白可以将细胞质中过量的Na+、K+、Ca2+和一些其他金属阳离子区域化至液泡中，一方面能够调节细胞的渗透势、促进水分的吸收，维持植物的正常生长;另一方面还可以缓解植物受外界环境影响所产生的离子毒害。因此，阐明液泡膜阳离子转运蛋白在植物抗逆中的作用，挖掘更多可利用的关键基因，对培育耐盐、抗旱作物新品种以及生态环境的恢复治理都具有十分重要的意义。目前，关于液泡膜阳离子转运蛋白的研究多集中于能够区域化Na+、K+的NHXs以及转运Ca2+的CAXs，并且对二者响应逆境胁迫的机制也有了一定的进展。但是，对定位于液泡膜上的其他阳离子转运蛋白功能的研究相对还不够深入。基于以上现状，今后的研究可从以下3个方面入手：①除一些常见的Na+/H+和Ca2+/H+逆向转运蛋白外，有关转运Cd2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+等金属阳离子的液泡膜转运蛋白的挖掘及其作用机制的研究还需进一步完善;②加强对各类阳离子转运蛋白之间协同作用的研究，以期建立相对完善的细胞质阳离子转运体系;③可以通过比较不同物种间的某个特定液泡膜阳离子转运蛋白与其抗逆性的关系，筛选可能导致这种差异的天然变异位点，为今后农作物及牧草的改良提供优异基因资源。

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