查 睿,尹 辉,刘 涛

(广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东药科大学广东省生物活性药物研究重点实验室,广东广州 510006)

顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)是一种长链,高度不饱和的n-3脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acid,n-3 PUFA)。它的酰基链中含有22 个碳,包括6 个双键。与二十碳五烯酸(Eicosapntemacnioc acid,EPA)和二十二碳五烯酸(Docosapentaenoic acid,DPA)相同,DHA在海洋生物中含量相当高。在人体,DHA主要存在于大脑和眼睛中。据报道,人婴儿大脑皮层和视网膜的平均DHA含量分别约占脂肪酸含量的8%和12%[1],因此DHA目前多被应用于补充大脑营养物质,提高认知能力,抵抗神经损伤。

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性复发性胃肠道的炎症疾病。临床上主要类型有克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)。IBD是遗传、环境和肠道微生物群之间复杂的相互交叉作用的慢性免疫介导疾病。虽然在全世界都有流行,但IBD高发病率的人群主要在北美和欧洲[2-3],且二十世纪下半叶发病率快速增长[2,4]。此外,之前被认为是“低风险”的国家如印度[5]和日本[6],其发病和患病人数也在逐渐增加。IBD的这种发病趋势,可能的原因之一是经过工业革命的欧美国家的饮食结构变成了以谷物和精制糖为主[7],从而间接摄入大量的脂肪,其中包括n-3和n-6脂肪酸,且以n-6脂肪酸居多[8-9]。

研究发现,n-6脂肪酸促进了许多疾病的发病,包括心血管疾病、癌症、肠炎等,而n-3多不饱和脂肪酸的增加(低n-6/n-3比例)会产生抑制作用[8,10-12]。随着IBD的发病率逐渐上升,人们开始研究n-3多不饱和脂肪酸对肠道炎症的具体作用,尽管目前的作用机制尚不清楚,但可以肯定其在包括肠道菌群[13]、炎症信号通路[14]、促炎介质释放[15]等方面均有显著的效果。DHA作为n-3多不饱和脂肪酸的主要成员之一,其生物学活性、食用和药用价值远不仅限在大脑神经方面,大量的实验结果显示DHA能有效缓解慢性结肠炎的发生发展,并且有调查表明,DHA的摄入量与CD的发展呈负相关[16],结肠炎相关研究已成为DHA药效评估的热点。

本文着眼于DHA及其衍生物,总结了近年DHA及其衍生物在各种肠炎模型进程中发挥的作用与效应,在世界各国炎症性肠病发病率日益上升的局势下探讨了该病更有效的用药方式和DHA的更多药用形式,为相关炎症疾病的用药和DHA的深入研究提供参考。

1 DHA作用机制和肠道炎症

根据目前的部分研究,人们已经对DHA的作用机制有了一定的理解,总结如图1。

图1 DHA主要作用机制和影响

DHA作为一种脂质,可以参与组成细胞膜磷脂,其高度不饱和的性质使得DHA的空间构型与其他常见的膜脂肪酸不同,这种形状对膜的构成有很大影响[17],进而影响膜蛋白功能和脂筏的组装,又因为膜磷脂是产生第二信使的底物,因此DHA的存在能够对磷脂及其产生的一些信号分子产生影响,如视觉信号分子、神经信号分子等[18-19]。游离的DHA能够通过细胞膜进入细胞,产生新的生物活性代谢产物,包括消退素(Resolvins)、保护素(Protectins)和马林素(Maresins)等,进入细胞内的DHA还可以通过过氧化物酶体增殖物激活受体(the Peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)的诱导和激活,抑制NF-κB通路[20],达到抑制炎症的效果;还可通过细胞膜上的G蛋白耦联受体之一的GPR120或Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR4)进入细胞激活细胞内的抗炎通路[21-22],从而缓解炎症。另外,DHA及其衍生物也能通过类似途径调节糖类和脂质代谢[23]。

1.1 DHA和鱼油可缓解肠道炎症损伤

DHA除了对细胞内信号分子的传递产生影响,还能激活细胞膜上或者细胞核内的激素受体,经过细胞内的代谢,形成的衍生物或代谢产物也在炎症消退方面具有显著的疗效。炎症性肠病之一的克罗恩病由于其广泛的异质表现且与其他炎性疾病重叠发病,常常难以观察到有特征的肠外症状,因此难以发现病因[24]。研究者们使用了白细胞介素-10敲除小鼠(该小鼠模型已被证明与人CD症状最为相似),用5%玉米油和4%鱼油(脂肪酸组成见表1[25])+1%玉米油完全平衡饮食。研究发现,喂食鱼油的小鼠在疾病发展前T细胞增殖水平显著降低,在非甾体抗炎药治疗后,鱼油组T细胞增殖减少,TNF-α的产生被抑制[25]。这在猪的体内也得到了类似结果,鱼油(脂肪酸组成见表2)喂养后的幼猪在LPS诱导炎症条件下能保持肠道完整性,研究显示其可能与TLR4和NOD2通路有关[26]。

表1 小鼠平衡饮食各脂肪酸含量

表2 幼猪平衡饮食各脂肪酸含量

而后在一组DHA给药的实验结果中,DHA能减少促炎细胞因子如IL-17、TNF-α和IFN-γ的表达[27]。Zhao等[28]发现,通过抑制TAK1/IKK-α/IkB-α/p65途径触发GPR120可能是克罗恩病的重要靶点。同时有研究表明,DHA可通过抑制mTOR途径触发自噬,从而减轻慢性结肠炎症状[29]。另外Kang等[30]发明的Fat-1转基因小鼠能够在不饱和脂肪酸烃链中添加双键并将n-6脂肪酸转化为n-3脂肪酸。该模型可被用于研究n-6/n-3多不饱和脂肪酸在疾病中的关联。在应用该模型的一系列实验中证实,n-3多不饱和脂肪酸能够有效缓解或预防胃肠道损伤疾病[31-32],并调节免疫细胞活性[33]。用2,4,6-三硝基苯磺酸(Trinitro ben-zene sulfonic acid,TNBS)造模前腹腔给药DHA 7 d以评估其预防效果,再用TNBS给药3 d后处死进行取材,结果显示,与Fat-1转基因小鼠的情况一样,DHA给药的野生型(Wild type,WT)小鼠免受TNBS诱导的结肠炎侵害,并且发现与抑制NF-κB活化、下调COX-2表达、激活Nrf2和在肠粘膜中上调HO-1表达有关[34]。

表3 DHA对PPARs的影响作用

1.2 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)与DHA

过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是一种核受体激素超家族成员,有三个亚家族成员:PPARα、PPARβ/δ和PPARγ。像所有的核受体一样,PPARs也有三个主要的功能域:N-末端结构域携带转录激活功能,一个保守的DNA结合结构域和一个C端结构域的配体结合域。PPARs可由脂肪酸及其衍生物激活,因此能够感知来自膳食脂质、致病性脂蛋白或必需脂肪酸代谢物的脂肪酸信号[35],目前已经被广泛用于治疗或缓解高脂血症和糖尿病等的研究。DHA与其它n-3脂肪酸代谢相关,它可以由植物来源的α-亚麻酸合成或直接从饮食中获得,因此研究者们开始探寻DHA与PPARs的联系。如表3所示,两者之间的关系在近年来的研究中也得到了证实。

最初,PPARs被发现在脂质和碳水化合物代谢中起重要作用,常被用作治疗糖尿病的靶向位点,之后的研究表明它们也参与调节炎症反应。研究已经证实DHA可作为PPARs的配体,主要通过激活PPARα/γ发挥作用,而结肠是除脂肪组织外表达这两种受体最多的组织[42]。在结肠炎的发生发展过程中,PPARγ信号通路的激活常常会预防结肠炎模型的表现,因其可抑制NF-κB促炎通路[21,43],而PPARα的作用却相反[44]。考虑PPARγ在结肠炎治疗中可能发挥的重要作用,目前其已成为结肠炎研究的热点方向之一。

2 DHA衍生物与肠道炎症

2.1 DHA代谢产物与炎症

DHA可以通过核受体发挥作用也表明其在细胞内参与了一些代谢反应,在炎症性肠病过程中除了DHA本身以外,其活性代谢产物也可能通过不同途径取得显著的抗炎效果,其中DHA产生的D系列消退素已经被证实在炎症性肠病中发挥有益的作用[45]。在DSS和2,4,6-三硝基苯磺酸诱导的结肠炎模型中,由阿司匹林诱导产生的消退素D1(Resolvin D1,AT-RvD1)、其前体17(R)-羟基二十二碳六烯酸和消退素D2(Resolvin D2,RvD2)均能有效改善两种模型的疾病表现,并且能够降低TNF-α、IL-1β、MIP-2和CXCL1/KC的结肠细胞因子水平,以及NF-κB和粘附分子VCAM-1、ICAM-1和LFA-的mRNA表达[45]。同样,二十二碳六烯酸衍生的脂质介质马林素1(Maresin 1,MaR1)在上述两种模型中也发挥了类似的缓解作用,此外,LPS刺激的骨髓来源的巨噬细胞培养物与MaR1的孵育减少了中性粒细胞迁移和活性氧物质的产生,还减少了IL-1β、TNF-α、IL-6和INF-γ的产生[46]。DHA的两种氧化产物17-氧代二十二碳六烯酸(17-Oxodocosahexaenoic acid,17-oxo-DHA)和神经前列腺素(Neuroprostanes),前者在转录测定中激活PPARγ和PPARα,可归类为α/γ双重激动剂[47],后者对PPARγ也具有较强的激活活性[48],因此在一定程度上它们的抗炎能力得到了证明。

2.2 DHA偶联物的抗炎作用

脂肪酸在生物体内的代谢过程中常会与其他物质相偶联,如与乙醇胺、单胺神经递质或氨基酸的缀合物,此前了解较多的是花生四烯酸乙醇胺(Arachidonoyl ethanolamine,AEA),研究表明其具有缓解炎症作用[49],且在肠道中作用显著[50]。二十二碳六烯酰乙醇胺(Docosahexaenoyl ethanolamine,DHEA)是AEA的n-3结构类似物,可以通过调节环氧合酶-2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的活性起到抗炎作用[51]。另一种有生物活性的DHA与5-羟色胺的缀合物,是内源性大麻素的同源物,又称为二十二碳六烯酸血清素(Docosahexaenoyl serotonin,DHA-5-HT),通过减弱IL-23-IL-17信号传导,并抑制CCL-20的释放起到抗炎的作用[52-53]。CCL-20是一种典型的Th17细胞产生的促炎介质,可协助Th17细胞参与慢性肠道炎症发病过程。而IL-17/Th17途径目前正在成为新的靶向治疗研究热点,因为它在类风湿性关节炎、多发性硬化、炎症性肠病以及癌症等疾病中都具有治疗潜力[54]。

近年的研究发现了一种新型的DHA偶联物——苄胺化二十二碳六烯酸(N-benzyl docosahexaenamide,NBDHA),从结构上看是由DHA与苄胺经酯化反应而成,如图2。

图2 NBDHA结构

该化合物最初是从天然植物玛咖中分离得到的,结构与玛咖中的其他酰胺类化合物类似,故并称为玛咖酰胺(Macamides)。玛咖酰胺是一类存在于天然植物玛咖中的特征物质,在2000年被首次发现[55],其共同点是不同种类的脂肪酸与苄胺缩合形成的酰胺类脂肪酸衍生物。截至目前已经发现了四十多种玛咖酰胺类化合物,如不饱和的苄胺化十四碳二烯酸,苄胺化十六碳三烯酸等。最初的研究证实玛咖酰胺具有改善性功能的效果[54],后来也有研究者发现玛咖酰胺具有抗疲劳和抗辐照损伤等功效[56],近年来玛咖酰胺的抗炎活性也被发现,并有研究指出玛咖酰胺与内源性大麻素系统之间的联系[57-59],能够起到止痛抗炎和神经保护的作用。尽管研究已经发现NBDHA存在于天然玛咖中,但在天然植物中含量极低,分离纯化的成本高昂,NBDHA作为一种典型的玛咖酰胺类化合物和具有高不饱和度的DHA衍生物,含有潜在的更为可观的药物研究价值,因此有研究者提出了较高效的NBDHA的合成方法,大大降低了分离纯化的成本。NBDHA关于肠道炎症的研究尚欠缺,未来有望在化学合成技术支持的基础上,从肠道炎症及相关领域研究中获得更多的关注和研究借鉴。

3 DHA联合用药

早在2001年就有学者证实了使用DHA与紫杉醇进行共价结合能够更加有效的抑制肿瘤的生长,同样是最佳剂量的条件下,120 mg/kg的DHA-紫杉醇结合物能够使10 只小鼠肺肿瘤完全消退,而20 mg/kg的紫杉醇仅仅能使10 只小鼠的肺肿瘤生长减缓,不能起到消退作用[60],基于该结果在2004年进行了临床试验研究,尽管标本量较少,但一些患者的病情得到缓解或发展稳定[61]。此后,DHA被用于治疗药物的联合用药研究逐渐开展,主要集中在癌症用药,如胃癌、肝癌[62-63]等,结果均表现出更显著的促凋亡效果。另外与神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)的联用能够加快神经损伤恢复[64]。虽然DHA在结肠炎的联合用药研究较少,但在结肠炎的临床治疗中,已经有研究显示n-3脂肪酸可对5-氨基水杨酸(5-Aminosalicylic acid,5-ASA)的疗效起到辅助效果[65]。在一项用于治疗IBD患者的营养搭配专利中,优化方案之一为TNF-α抑制剂和含有EPA、DHA等必需脂肪酸类的组合营养物[66]。在鱼油的辅助治疗中,n-3脂肪酸和5-ASA均能够抑制PGE2和LTB4的产生,联合治疗后显示减少NF-κB活化和诱导PPARγ激活,并且使用n-3脂肪酸可以减少常规疗法的用药剂量[65]。现阶段研究者们在肠炎治疗中的联合用药主要为脂肪酸混合物,这主要是基于单体脂肪酸获取成本高,以及不同n-3脂肪酸的作用效果和机制尚未明确的考虑。研究表明脂肪酸混合物的联合用药有一定的辅助疗效,但从表1、表2可以看出鱼油中n-3脂肪酸的比例并不高,且含有大量的n-6脂肪酸,由于不同脂肪酸的作用机制差异,可能会对辅助药效产生影响,应用DHA等脂肪酸单体进行辅助治疗或许可以获得更加稳定且靶向明确的效果。随着获取方法的优化和发展,DHA单体可以作为一个辅助用药的研究方向进行探讨。

4 讨论与展望

已有研究证实,DHA及其相关产物能够显著抑制促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6等的释放,激活膜受体GPR120、TLR4和核受体PPARs,抑制NF-κB通路活化,还能激活自噬通路,上调肠道上皮屏障相关蛋白表达,使被破坏的肠粘膜得到恢复。DHA及其相关产物缓解肠炎的机制较为相似,可能与结构和性质相关,因其脂溶性特质和特殊的代谢过程,DHA可能会参与很多不同的炎症消退机制,与其他药物或许可以有很好的协同作用,但是目前这方面的研究还不够完善,在以后的研究中DHA代谢相关途径和机制或将成为IBD治疗探究的一大方向。在炎症性肠病的治疗方案中,现有的治疗方案由于病因不明无法对症下药,且因患者体质差异易导致药效不稳。考虑加入DHA等n-3不饱和脂肪酸或其类似物作为补充剂协助治疗,能够有助于治疗药物的药效发挥,减少药效不稳带来的弊端。DHA的相关产物联合用药的效果和机制还有待探索,且机制研究或许可以帮助探明炎症性肠病的病因,为疾病的治疗铺路,也为天然产物的开发利用提供借鉴。