林 琳,陈文庆,方厚智,高 杰,崔海英

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

大肠杆菌O157∶H7(E.coliO157∶H7)为一种肠道病原体,可引发多种严重疾病,相关研究表明,一些果蔬易被大肠杆菌O157∶H7污染,且能在各种食品加工材料表面以及果蔬表面形成生物膜,威胁食用者健康[1-3]。生物膜是细菌利用其自身分泌的多糖类基质,将细菌小菌落连接到惰性表面,同时将其它碎屑,包括营养物质和细菌也截留在其中,最终形成一层坚固的薄膜,难以清除。传统的化学杀菌虽能在一定程度上灭菌,但同时也破坏了果蔬内的营养物质,且果蔬表面会有化学试剂残留,不能达到保证果蔬感官品质和营养品质的同时有效杀灭细菌的目的[4]。

目前,等离子体处理作为一种物理杀菌保鲜技术,已被欧美等发达国家所普遍接受[5-8]。其中,冷等离子体不仅能够杀死果蔬表面的致病微生物[9-12],还可以降解农药残留,且无次生污染物,十分符合果蔬采后贮藏保鲜的需要[13-14]。大气压冷等离子体(atmospheric cold plasma,ACP)是等离子体家族的新秀,是在一个大气压条件下通过给被介质隔开的电极施加高能量产生[15-16]。由于ACP是在大气压条件下产生,不需昂贵的真空设备和复杂耗时的操作程序,与传统的低气压等离子体技术相比可降低成本,提高杀菌效率,具有明显的优势[17-19]。任翠荣等[20]研究了ACP处理对草莓保鲜效果的影响,结果表明在140 V下处理60 s时,草莓的保鲜效果最好;张志伟[21]研究了ACP对鲜切胡萝卜表面金黄色葡萄球菌的杀菌效果及品质影响,结果表明在170 V下,处理5 min时,杀菌率达到92.35%,同时保持了胡萝卜的理化品质;Misra等[22]研究了ACP处理对草莓表面微生物的灭活作用,发现ACP处理5 min后,在未影响草莓感官品质的同时,草莓表面菌落数减少了两个数量级。但目前国内外对ACP冷杀菌技术在果蔬表面生物膜的清除及其抗菌机制方面研究甚少。

本文探究了ACP清除E.coliO157∶H7生物膜的最佳处理功率和处理时间,观察了E.coliO157∶H7生物膜在ACP处理前和处理后的形态变化,同时研究了ACP处理对E.coliO157∶H7生物膜的抗菌机制,最后以户太葡萄、圣女果、维多利亚青提、生菜为研究对象,将ACP处理应用到这四种果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的清除,以期探究ACP的抗菌机制及应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

E.coliO157∶H7(CICC 21530) 中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)提供;胰酪大豆胨液体培养基(Trypticase soy broth medium,TSB) 杭州微生物试剂有限公司;鱼粉蛋白胨、琼脂 青岛海博生物科技有限公司;牛肉浸膏 北京奥博星有限公司;氯化钠、无水磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、硫酸、氯仿 国药集团化学试剂有限公司;苯酚、异戊醇、乙醇、醋酸钠 上海阿拉丁有限公司;新鲜户太葡萄、维多利亚青提、圣女果、生菜 购于江苏大学凯源超市。

APLM-SP-YB-D1KW-3232328-2-5大气压冷等离子体装置 南京爱特维电子科技有限公司;TGL-16K高速冷冻离心机 湖南湘仪有限公司;Scizntz-D超声波细胞破碎仪 宁波新芝有限公司;Infinite 200 PRO酶标仪 瑞士Tecan公司;UV2550紫外分光光度计 日本岛津公司;Color Quest XE分光测色仪 美国HunterLab公司。

1.2 实验方法

1.2.1 ACP处理对E.coliO157∶H7生物膜的清除作用测定 将无菌不锈钢片(2 cm×2 cm)加入到接有E.coliO157∶H7菌液(105～106CFU/mL)的TSB培养基中,25 ℃下培养5 d,期间每天更换一次灭过菌的TSB培养基,5 d后将不锈钢片取出至无菌培养皿中,用无菌PBS浸泡清洗30 min,以除去游离的E.coliO157∶H7。然后送至大气压冷等离子体装置的载物台进行ACP处理,控制处理时间为2 min,处理功率分别为0、200、300、400、500、600 W以确定最佳处理功率;控制处理功率为400 W,处理时间分别为0、1、2、3、4、5 min以确定最佳处理时间,未经ACP处理的不锈钢片作为空白。处理结束后将不锈钢片置于含有20 mL无菌PBS的离心管中,超声10 min以使不锈钢片表面的生物膜分离形成浮游细菌。然后将所得菌悬液十倍梯度稀释,涂布于NA琼脂培养基,24 h后测定残存菌数[23]。ACP处理对E.coliO157∶H7生物膜的清除率的计算公式:

1.2.2 场发射扫描电镜观察E.coliO157∶H7生物膜 将尼龙片(1 cm×1 cm)用无水乙醇浸泡,超声清洗4 h,121 ℃灭菌30 min。将无菌尼龙片加入接有E.coliO157∶H7菌液(105～106CFU/mL)的TSB培养基中,25 ℃下培养5 d,期间每隔24 h用移液枪吸走全部TSB培养基,并加入等量全新的灭过菌的TSB培养基,5 d后将不锈钢片取出,用无菌PBS清洗三次后晾干,随后用ACP处理,未经ACP处理的尼龙片作为空白。最后用场发射扫描电镜观察处理组与空白组的生物膜变化情况[23]。

1.2.3 ACP处理对E.coliO157∶H7生物膜的抑制机制研究 胞外聚合物中多糖、蛋白质及DNA含量测定参考柏梅[24]山苍子精油对胞外聚合物中多糖、蛋白质及DNA影响的实验方法,将山苍子精油处理改为ACP处理。

1.2.4 ACP处理对四种果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的清除作用评价 取约大小为1 cm×1 cm的葡萄皮浸泡在100 ppm的次氯酸钠溶液中,超声1 h后,置于超净台中,紫外灭菌1 h以除去葡萄皮表面原有微生物,然后将葡萄皮加入到接有E.coliO157∶H7菌液(105～106CFU/mL)的TSB培养基中,25 ℃下培养3 d,期间每隔24 h用移液枪吸走全部TSB培养基,并加入等量全新的灭过菌的TSB培养基,3 d后将葡萄皮取出至无菌培养皿中,用无菌PBS浸泡清洗30 min,以除去游离的E.coliO157∶H7。待葡萄皮自然晾干后,取六片葡萄皮在最佳处理功率和处理时间条件下进行ACP处理,每次只处理一片葡萄皮,未经ACP处理的葡萄皮作为空白。

表1 葡萄感官评分表Table 1 Sensory evaluation standards of grape

取其中一片处理组葡萄皮和空白组葡萄皮置于两个盛有PBS的无菌均质袋中,拍打式均质器均质15～20 s,制成1∶5的样品匀液,将所得样品匀液十倍梯度稀释,涂布于NA琼脂培养基,24 h后测定残存菌数。剩下五片处理组葡萄皮和五片空白组葡萄皮于12 ℃下贮藏,分别待1、2、3、4、5 d后按上述步骤均质、稀释、涂布、计数。另取12片培养有E.coliO157∶H7生物膜的葡萄皮均分为两组,按上述步骤进行两次重复实验。取新鲜的圣女果、维多利亚青提和生菜作为测试果蔬,按上述步骤处理样品以评价ACP处理对其表面E.coliO157∶H7生物膜的清除作用[25]。

1.2.5 色泽测定 由于购买来的整粒葡萄颜色深浅不一,测色泽时会产生较大误差,取颜色深浅较为均一的半粒葡萄作为测试样品,在相同部位进行ACP处理,处理结束后立即采用分光测色仪分析表面颜色变化,得出L*、a*、b*值,未经ACP处理的葡萄作为空白组。

1.2.6 感官评定 在江苏大学随机选取30位师生对空白组和处理组的葡萄的感官性能(外观、颜色、味道、总体接受性)作出评价打分,1～9分代表喜欢的不同程度[26]。另取新鲜的圣女果、维多利亚青提和生菜作为测试果蔬,按上述步骤评价各个果蔬的感官性能。

1.3 数据处理

所有实验重复三次,实验结果采用平均值±标准误差的形式,使用SPSS软件(IBM 21.0版本)中的单因素方差分析对空白组和实验组进行显著性分析(P<0.05表明有显著性差异,图中用*表示),Origin 8.5软件进行分析作图。

2 结果与分析

2.1 ACP处理对E. coli O157∶H7生物膜的清除作用

2.1.1 ACP最佳处理功率的确定 如图1所示,未经ACP处理的不锈钢片表面生物膜活菌数为1.05×105CFU/cm2,随着处理功率增加至400 W,不锈钢片表面生物膜活菌数逐渐降至3.50×103CFU/cm2,与未经ACP处理的不锈钢片表面生物膜活菌数相比差异显著(P<0.05)。继续增加处理功率,活菌数逐渐回升至6.55×104CFU/cm2,由此可见,在处理功率为400 W条件下,不锈钢片表面生物膜残存活菌数最低,对应的生物膜清除率达到最高,可清除97.66%±0.28%的E.coliO157∶H7。可能是因为在此功率下冷等离子体释放出的自由基、离子、受激分子等活性粒子作用于生物膜,使细胞膜通透性增加,导致胞内物质大量泄漏,促使细胞凋亡[20-21];另外冷等离子体释放出的活性粒子可能也会降低胞外聚合物中多糖、蛋白质等物质的含量,导致生物膜被离散、瓦解。因此选择400 W作为ACP的最佳处理功率。

图1 ACP最佳处理功率的确定Fig.1 Determination of optimal ACP processing power注:*表示与空白相比,差异显著(P<0.05)。图2、图4、图5同。

2.1.2 ACP最佳处理时间的确定 如图2所示,未经ACP处理的不锈钢片表面生物膜活菌数约为1.23×106CFU/cm2,随着处理时间增加至3 min,不锈钢片表面生物膜活菌数逐渐降至3.02×103CFU/cm2,与未经ACP处理的不锈钢片表面生物膜活菌数相比差异显著(P<0.05)。继续增加处理时间至4 min,活菌数回升至1.78×104CFU/cm2,当处理时间为5 min时,活菌数回落至7.08×103CFU/cm2,由此可见,处理时间在3、4、5 min时,残存活菌数稳定在104CFU/cm2上下,在处理时间为3 min条件下,不锈钢片表面生物膜残存活菌数最低,对应的生物膜清除率达到最高,可清除99.75%±0.25%的E.coliO157∶H7,因此,选择3 min作为ACP的最佳处理时间。

图2 ACP最佳处理时间的确定Fig.2 Determination of optimal ACP processing time

图4 ACP处理后E. coli O157∶H7生物膜胞外物质游离程度变化Fig.4 Changes of biofilm extracellular materials after ACP treatment注:A:胞外聚合物中多糖含量变化;B:胞外聚合物中蛋白质含量变化;C:胞外聚合物中DNA含量变化。

2.2 场发射扫描电镜观察生物膜

图5 ACP处理对四种果蔬表面E. coli O157∶H7生物膜的清除作用评价Fig.5 Evaluation of clearance effect of ACP treatment on E. coli O157∶H7 biofilms on the surface of four fruits and vegetables注:A:户太葡萄;B:圣女果;C:维多利亚青提;D:生菜。

如图3所示,在场发射扫描电镜下,样品被放大至30000倍后,空白组中E.coliO157∶H7饱满光滑,大部分E.coliO157∶H7相互聚集在一起,黏附在尼龙片表面,形成致密的生物膜,只有极少数的游离细菌存在;经ACP处理后,已经观察不到致密的大范围的生物膜结构,大部分的E.coliO157∶H7以游离的方式分散开来,且部分E.coliO157∶H7内容物渗出,处于失活状态,E.coliO157∶H7生物膜基本被破坏,ACP处理达到了较佳的清除效果。

图3 场发射扫描电镜观察E. coli O157∶H7生物膜(30000×)Fig.3 Scanning electron microscope images ofE. coli O157∶H7 biofilms(30000×)注:A:空白组;B:处理组。

2.3 ACP处理对E. coli O157∶H7生物膜的抑制机制

胞外聚合物中多糖在细菌生物膜形成过程中可通过静电作用将细菌黏附在一起,由图4A可知,与空白组相比,经ACP处理后,E.coliO157∶H7的胞外聚合物中多糖含量显著降低(P<0.05)。ACP处理可抑制胞外聚合物中多糖的合成与分泌,从而抑制生物膜的形成。另外图4B反映了胞外聚合物中蛋白质含量相对空白组也显著降低(P<0.05),这也说明ACP处理可抑制E. coli O157∶H7胞外聚合物中蛋白质的合成与分泌,但ACP处理并没有影响胞外聚合物中DNA的含量,图4C中空白组与处理组的胞外聚合物中DNA含量差异不显著。

2.4 ACP处理对四种果蔬表面E. coli O157∶H7生物膜的清除作用评价

表2 ACP处理对四种果蔬色泽和感官品质的影响Table 2 Effects of ACP treatment on color and sensory quality of four kinds of fruits and vegetables

图5结果显示,与空白组相比,在400 W下经ACP处理3 min后的四种果蔬表面生物膜中残存活菌数均大大降低,在处理当天,户太葡萄、圣女果、维多利亚青提及生菜表面残存活菌数分别降低了98.99%±0.38%、99.92%±0.20%、96.84%±0.18%、99.80%±0.23%。户太葡萄与维多利亚青提的表面残存活菌数于ACP处理后2 d达到最低,圣女果表面的残存活菌数则在1 d后即达到最低,之后残存活菌数均先缓慢上升后缓慢下降,而生菜在ACP处理完后的2 d内残存活菌数缓慢上升,之后缓慢下降,但5 d内四种果蔬表面的残存活菌数仍在抑制范围内。四种果蔬表面的残存活菌数第二次下降的原因可能是果蔬表皮的营养已经不足,无法满足E.coliO157∶H7的生长、代谢活动,导致残存活菌数再次降低。另外,不同果蔬表面残存的活菌数不同可能是因为果蔬表面的粗糙度不同,造成了E.coliO157∶H7生物膜形成的差异,其中,生菜表面残存活菌数最多,由此可见,生菜表面较易适合E.coliO157∶H7生物膜的形成,这可能与生菜表面密集的气孔有关。综合四种果蔬空白组与处理组表面的残存菌数变化来看,ACP处理可在1～2 d内使户太葡萄、圣女果、维多利亚青提表面残存活菌数降至最低,而生菜在处理当天表面残存活菌数达到最低,但在5 d内四种果蔬表面残存活菌数均在抑制范围内,达到了较佳的生物膜清除效果,延长了果蔬的贮藏期。

2.5 色泽测定和感官评定

由表2可知,在400 W的功率下,采用ACP处理3 min后,户太葡萄的a*值有所上升,L*值、b*值略微降低,表明ACP处理后,户太葡萄色泽略微不如新鲜的户太葡萄,但影响不大;圣女果的L*值基本维持不变,a*值和b*值均有较大上升,表明ACP处理略微加深了圣女果的色泽;维多利亚青提的L*值和b*值有明显下降,但a*值略微上升,表明ACP处理略微减淡了维多利亚青提的色泽;生菜的L*值和a*值略微下降,但b*值略微上升,表明ACP处理略微减淡了维多利亚青提的色泽。另外,四种果蔬的外观、颜色、味道虽有所变化,但总体上也能被接受。综上所述,ACP处理虽对四种果蔬的色泽和感官品质略有影响,但仍能被大家所接受。

3 结论

大气压等离子体处理对E.coliO157∶H7生物膜表现出了较好的清除作用。在最佳处理功率400 W,最佳处理时间3 min条件下,ACP通过抑制胞外聚合物中多糖及蛋白质的合成与分泌来抑制生物膜的形成,表现出了最佳的清除效果;另外,通过场发射扫描电镜也能观察到在经ACP处理后E.coliO157∶H7生物膜大幅度被清除,大部分E.coliO157∶H7由聚集状态转变为游离状态。当ACP应用于户太葡萄、圣女果、维多利亚青提及生菜这四种果蔬表面的E.coliO157∶H7生物膜的清除时,在处理当天及在5 d内表现出了明显的抑制效果,延长了四种果蔬的贮藏期。同时,感官评定结果表明,ACP处理基本不影响四种果蔬的感官品质,加之ACP是在大气压条件下产生,不需昂贵的真空设备和复杂耗时的操作程序,因此,在果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的清除过程中,可以引进ACP处理,以减少果蔬表面E.coliO157∶H7生物膜的污染,提高果蔬的食用安全性。另外,可以进一步研究ACP处理对其他细菌生物膜的清除效果及机制,为ACP处理更广阔的应用在果蔬贮藏保鲜领域奠定理论基础。