刘 冉,曾庆华,*,王振宇,程 霜,穆洪静,梁 荣

(1.聊城大学农学院,山东聊城 252000; 2.哈尔滨工业大学化学与化工学院,黑龙江哈尔滨 150000; 3.山东省高唐蓝山集团总公司,山东聊城 252000)

大豆分离蛋白(Soybean protein isolate,SPI)以其优良的加工性能、较高的营养价值和较低的成本在食品行业得到广泛的应用[1-2]。SPI的主要成分是贮藏蛋白,分别为7S球蛋白(β-伴球蛋白)和11S球蛋白(大豆球蛋白),它们占总蛋白的65%～80%。SPI具有乳化性、溶解性、凝胶性、分散性和黏弹性等功能特性，使其在不同的食品中具有不同的应用形式[3]。SPI功能特性主要取决于其蛋白组成、结构、变性和聚集程度。蛋白凝胶特性可以将水分、脂肪、风味以及色素物质包裹在三维网络结构中,对于食品品质和食品纹理的形成具有非常重要的作用。热、酸、盐、酶等方式均能诱导蛋白凝胶形成,但热处理是食品加工中最常见、最基本的处理手段。SPI热致凝胶形成是一个多步骤反应,首先需要加热使多肽链展开暴露更多的作用位点,然后展开的蛋白质分子相互作用并发生聚集,最后聚集体凝聚形成网络结构[4]。SPI凝胶能力和黏弹性能很大程度上取决于自发的相互作用,如氢键和共价键(二硫键),静电和疏水相互作用[5]。目前,商业化生产的SPI仍然采用碱提酸沉+喷雾干燥的方式进行生产,致使蛋白发生一定程度的变性,溶解性下降,导致了SPI的凝胶特性变差。因此,如何改善商用SPI的凝胶特性是SPI加工与应用亟待解决的问题。

许多技术被用来修饰和改变大豆蛋白的结构和聚集性,从而改善其功能特性。超声波技术是一种常见的物理技术,广泛应用于辅助成分提取领域[6-7]。其操作特点是简单、节能、省时和环保。高强度的超声波技术是基于低频振荡产生的空化效应、机械效应和热效应[8]。近年来,超声波的研究重点转移到利用超声波对各种生物大分子物质进行改性和降解。超声通过破坏非共价相互作用,甚至可以断裂肽键,引起结构的变化,同时也会引起其功能特性的改变[9-10]。涂宗财等研究表明20 kHz 400 W超声波处理使大豆分离蛋白平均粒径减小,溶解性增加,表面疏水性增强,二级结构改变,可以促进大豆分离蛋白形成结构均匀、致密的TG改性凝胶[11]。Hu等研究发现20 kHz 400 W超声处理促使钙离子诱导的SPI形成结构更加致密均一的三维凝胶结构,并提高其凝胶持水性和凝胶强度[12]。Zhang等研究表明,高强度超声波可以打开SPI空间结构,暴露更多的转谷氨酰胺酶的作用位点,从而使转谷氨酰胺酶诱导形成的凝胶强度更大[13]。

本研究目的在于将超声波作为商用SPI改性的手段以提高其热凝胶特性。研究采用不同功率的超声波处理SPI分散液,首先测定超声波对SPI分散液流变特性的影响,再通过动态温度、时间和频率扫描,监测SPI分散液热凝胶形成的过程,分析超声波对SPI凝胶形成和凝胶流变特性的影响。研究结果可为改善SPI凝胶特性和扩大其应用范围提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPI 高唐蓝山基团有限公司提供。

DHR-1型旋转流变仪 美国TA公司;JY92-Ⅱ型超声波细胞粉碎机 宁波新艺超声设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超声波处理SPI分散液 参照胡昊[14]的方法,略作改动。准确称取5 g SPI在100 mL烧杯中,加入蒸馏水配制成12 g/100 mL SPI分散液,在室温下磁力搅拌2 h至充分溶解,并放置于4 ℃冰箱中备用。用直径为0.636 cm的超声波探头深入大豆蛋白溶液表面1～2 cm来处理SPI分散液。使用0 W超声功率的SPI分散液作为对照组,其余样品分别用超声功率(100、200、400、600、800 W)处理,超声总时间为10 min。单次超声处理时间为5 s,间隔3 s。

1.2.2 流变特性的试验 将SPI分散液样品放置在流变仪的平板上,平板间距设置为1.0 mm。用刮刀去除外板上多余的样品,表面涂硅油,防止水分蒸发。样品在测试前平衡5 min,以卸载试样添加过程中的残余应力,并保持恒温。

1.2.2.1 频率扫描试验 参照胡昊[14]的方法,略作改动。选择直径40 mm平板夹具,应变设置为0.5%(处于线性黏弹区域内),频率设置为1 Hz,初始温度设置为20 ℃,对SPI样品进行频率扫描0.1～10 Hz,温度设置为20 ℃。测G′、G″和tanδ随频率的变化。

1.2.2.2 剪切速率扫描试验 参照胡昊[14]的方法,略作改动。选择直径40 mm,锥度1.998 °的锥板夹具进行SPI样品剪切速率扫描。剪切速率测定范围0.1～100 s-1,测定过程中黏度和剪切应力的变化。

1.2.2.3 凝胶形成模拟试验 参照Peyrano等[15]的方法,略作改动。选择直径40 mm平板夹具,应变设置为0.5%(处于线性黏弹区域内),频率设置为1 Hz,初始温度设置为20 ℃,对SPI分散液进行温度扫描和时间扫描,以监测凝胶形成全过程。凝胶形成试验分三个阶段进行:a.加热阶段:温度以3 ℃/min速率从20 ℃上升至90 ℃;b.热平衡阶段:温度为90 ℃保持20 min;(3)冷却阶段:温度以3 ℃/min速率从90 ℃下降至20 ℃。测定G′、G″和tanδ随温度和时间的变化。测试结束后,立即对形成的凝胶进行频率扫描试验,方法如1.2.2.1。

1.3 数据处理

所有试验均重复3次,结果表示为平均值±标准差。利用minitab 17.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 超声波处理对SPI分散液流变特性的影响

2.1.1 超声波处理对SPI分散液黏弹性的影响 G′为储能模量(弹性模量)，表示物质阻止变形的能力,表征材料弹性特征。G″为损耗模量(黏性模量)，表示物质阻止流动的能力,表征材料特征。G″/G′称为损耗因子,用tanδ表示,表征材料是类似固体特征行为还是液体特征行为,如果tanδ等于0,材料突出固体弹性行为;tanδ等于1,材料突出液体黏性行为;当tanδ介于0～1之间,表明材料既有黏性成分,又有弹性成分,材料表现出黏弹性[16-17]。因此G′、G″和tanδ用以表示物质的黏弹性,反映材料结构特性。如图1～图3所示,对照组SPI分散液的起始模量G′和G″较大,且G′大于G″,使分散液表现为类固体的特征。这是因为商用的SPI由于其加工工艺如碱提酸沉和喷雾干燥的原因,导致蛋白发生了很大程度的变性,将其分散到水中时形成了不溶性聚集体或沉淀物。这些大而稳定的宏观聚集物会被剧烈的机械或均质作用破坏形成小的聚集体[18]。超声波由于空穴和剪切作用可以破坏并打散不溶性的聚集体,并将部分不溶性聚集体转变成可溶性的聚集体。因此超声波可以引起模量(G′和G″)减小和tanδ增大,改变了原有SPI分散液的黏弹结构,从而使其更接近于液体状态。胡昊在研究高场强超声波对商用SPI结构和功能特性影响时也有相似的结果,超声处理会降低SPI分子或聚合物之间的相互作用,使SPI分散液接近类液体状态[19]。

图1 超声波处理对SPI分散液G′的影响Fig.1 Effects of ultrasonic treatment on G′ of SPI dispersions

图2 超声波处理对SPI分散液G″的影响Fig.2 Effects of ultrasonic treatment on G″ of SPI dispersions

图3 超声波处理对SPI分散液tanδ的影响Fig.3 Effects of ultrasonic treatmenton tanδ of SPI dispersions

2.1.2 超声波对SPI分散液黏度的影响 SPI分散液的黏度与剪切速率的关系如图4所示。随着剪切速率的增加,SPI凝胶的黏度均逐渐下降,表现出典型剪切变稀的非牛顿流体特征。田少君等研究指出,大豆蛋白溶液在低浓度下(<6%)表现为牛顿流体,在高浓度(>6%)下表现为非牛顿流体[20]。这是由于高浓度的蛋白颗粒随流动方向逐渐定向,摩擦阻力减小;SPI颗粒也随流动方向发生相应的形变;流动过程产生的剪切力会引起非共价键的断裂,从而引起聚集体的解体[15]。与对照组相比,在相同剪切速率下,超声波处理引起了SPI分散液表观黏度的减小。这主要是超声波减小了SPI颗粒的粒径引起的。与超声波对SPI分散液G′和G″的影响一致,表观黏度并未随超声功率的增加而逐渐减小。与其他功率相比,400和600 W表观黏度相对较大,可能由于400、600 W超声处理可以引起SPI颗粒的重聚集,造成粒径的增大,从而影响了黏度。

图4 SPI分散液黏度随剪切速率的变化曲线Fig.4 Curves of viscosity of SPI gel with shear rate

2.2 超声波对SPI热凝胶化的影响

图5 SPI分散液的热凝胶曲线Fig.5 Thermal gelation curves of SPI注:对照组(A);100 W超声处理组(B);200 W超声处理组(C);400 W超声处理组(D);600 W超声处理组(E);800 W超声处理组(F)。

2.2.1 超声波对SPI热致凝胶形成过程的影响 SPI热致凝胶形成过程分为3步,第一步大豆蛋白变性去折叠;第二步变性的大豆蛋白聚集;第三步,大豆蛋白聚集体交联形成网状结构。因此SPI凝胶能力和黏弹性能很大程度都依赖于自发的相互作用,如氢键和共价键,静电相互作用和疏水相互作用[21]。本研究采用小振幅振荡扫描模拟SPI凝胶形成过程。图5显示SPI分散液的热致凝胶形成曲线随时间的变化,在加热-平衡-冷却的热循环过程中,SPI样品的G′和G″随时间的变化趋势基本一致,表现出先下降后升高的趋势。加热起始阶段,SPI分散液受到外部应力的作用,黏弹结构遭到破坏,蛋白质-蛋白质和蛋白质-水之间的氢键也随温度升高发生断裂,因此G′和G″随温度的升高而下降[22]。当温度达到SPI变性温度以后,SPI的高级结构遭到破坏,分子去折叠,内部疏水基团、巯基和二硫键逐渐暴露,分子结构变伸展,蛋白分子发生聚集,G′和G″开始增大。若G′增加速度大于G″,则出现G′和G″的交点,即凝胶点(PCO)出现,标志三维网络结构开始建立[23]。随后,蛋白分子继续发生聚集并发生交联,模量不断增加,网络结构不断加强,当tanδ达到0.3(Pt0.3)时,预示凝胶已经形成了良好的网络结构[24]。

表1 热凝胶化的相关参数Table 1 Thermal gelation parameters

未经超声处理的SPI对照组的凝胶曲线如图5A显示,热处理阶段G′和G″一直不断减小,直到冷却阶段才开始增大,在冷却温度降至87.83±3.65 ℃时PCO出现,此时凝胶网络结构才刚刚开始建立。在冷却结束时,G′仅为17.80±1.38 Pa,凝胶强度较弱,tanδ为0.49±0.03未达到0.3,未能形成良好的网络结构(表1)。商用SPI由于溶解性差,分散液中有部分不溶性聚集体存在,凝胶形成过程中疏水相互作用并未发挥优势,主要由氢键参与了网络结构的构建,导致其热诱导形成的凝胶强度低,网络结构差。因此商用SPI的凝胶性能比较差。100 W超声处理组在整个热循环过程中,G″基本上一直处于大于G′的状态,凝胶未形成(图5B)。100 W超声处理明显降低了SPI凝胶能力,这可能是由于100 W超声处理后的SPI颗粒粒径减小程度较大,导致蛋白颗粒之间空隙增加以及与水分子作用力增强,从而减弱了凝胶形成时所需的蛋白与蛋白之间的相互作用力,因此在热循环过程未能实现蛋白颗粒的聚集和交联。200、400和600 W超声处理组具有相似凝胶形成曲线,且与对照组相比发生了很大的变化(图5C、D、E)。一方面,超声波促使凝胶点提前出现,加速了凝胶形成。200和600 W超声组其PCO在热平衡阶段的初期就已经出现;特别是400 W超声组SPI在进行热循环之前就已经形成了微弱的凝胶结构,且在整个热循环过程中G′始终大于G″。一般认为,SPI凝胶形成依靠各种相互作用力的共同作用的结果,但疏水相互作用和氢键起到了决定性的作用[25-26]。PCO过后,模量随高温处理时间延长快速增大,蛋白质在高温下暴露足够长的时间建立热促进相互作用,从而产生了大量的疏水相互作用,这对于凝胶网络结构的建立起到关键作用[27]。另一方面,超声波促使SPI凝胶建立更加稳定的矩阵结构。200～600 W超声处理组均能在冷却阶段或热平衡阶段达到Pt0.3,而未超声处理的SPI却始终未能达到Pt0.3。说明,超声波处理后SPI聚集体可以发生更加有序地交联,形成良好的矩阵结构。从图5C、D、E中可知,在冷却阶段模量增加的速度比热平衡阶段还要快,是由于氢键作用的加强,帮助SPI凝胶建立更加稳定网络结构,因此在冷却阶段结束时,与对照组相比具有更大的G′和G″,同时具有更小tanδ,即200～600 W超声波促进SPI形成强度高、结构稳定的凝胶。800 W超声处理组的凝胶曲线如图5F显示,在加热阶段和热平衡阶段G′小于G″,一直处于溶液状态,直到冷却温度降至77.13±4.04 ℃时才达到PCO,冷却结束时G′为5.24±0.63 Pa,tanδ为0.52±0.03,凝胶性能与对照组相比有所下降。800 W超声处理降低了SPI的胶凝能力。这有可能是因为高功率的超声波导致肽键的断裂,造成SPI的降解,影响了蛋白质分子间的交联,从而导致其凝胶能力的下降。

2.2.2 超声波对SPI热致凝胶黏弹性的影响 在频率扫描过程中,样品粒子之间化学键可以自发生成,也可以在外力作用下发生断裂。化学键的生成或断裂导致物质结构发生变化,从而影响流变性能[28]。SPI热致凝胶G′、G″与频率之间的关系如图6、图7所示。在0.1～10 Hz内,G′和G″随频率的增加而增加,对频率具有一定的依赖性。超声处理组与对照组的黏弹性显示出明显的差别。其中,200、400和600 W超声处理组G′和G″都明显高于对照组,显示出较好的黏弹性,且400 W具有最大的G′和G″。tanδ可以反映凝胶的网络性质,tanδ越小表示凝胶网络结构越好,当tanδ等于0.3时,预示凝胶建立了良好的网络结构。由图8可知,400 W超声处理组的SPI热致凝胶的tanδ最小,且小于0.3,表明此条件下形成的凝胶结构最稳定。SPI热致凝胶的频率扫描试验结果表明,适当功率的超声预处理可以提高SPI热致凝胶的黏弹性能,并能促进凝胶形成更加稳定的网络结构。相反,低功率组的SPI分散液未能形成凝胶(G′G″),但凝胶强度小(G′小),网络结构差(tanδ大)。由此可知,超声波会引起SPI凝胶特性的改变,不同功率的处理效果可能是截然相反的,只有适当功率的超声处理才能明显提高SPI的凝胶特性。很多研究也得出了类似的结果。叶钰等在研究超声波对蛋清蛋白凝胶特性的影响时发现,200和400 W超声波处理可以显著增强凝胶强度,但600 W、30 min超声波处理下,蛋清蛋白的凝胶强度降低了[29]。Li在研究超声波对黑豆蛋白凝胶特性影响的结果也表明,中功率(300 W)的超声波处理后的黑豆蛋白凝胶质构和凝胶结构都优于低功率(150 W)和高功率(450 W)[30]。虽然,此类研究都得出一致的结果,中功率超声波提高蛋白凝胶特性效果要优于低功率和高功率,但不同的种类的蛋白质和不同的超声时间下适当功率的数值并不是一致的。

图6 超声处理对SPI热致凝胶G′的影响Fig.6 G′ of formed gels from ultrasonic-treatedSPI dispersions with frequency

图7 超声处理对SPI热致凝胶G″的影响Fig.7 G″ of formed gels from ultrasonic-treatedSPI dispersions with frequency

图8 超声处理对SPI热致凝胶tanδ的影响Fig.8 Tanδ of formed gels from ultrasonic-treatedSPI dispersions with frequency

利用频率扫描可以把蛋白凝胶分成三种类型:聚合型凝胶(缠绕型网络)、化学型凝胶(共价交联网络)、物理型凝胶(非共价交联网络)[15]。聚合型凝胶是一类非常弱的凝胶,也被成为软凝胶(soft gel),模量对频率具有较高的依赖性,出现G′-G″交点[31]。化学型蛋白凝胶属于强凝胶,具有永久性共价网络结构,模量不依赖频率或依赖性非常小[32]。物理型蛋白凝胶介于弱凝胶与强凝胶之间,储能模量对频率具有一定的依赖性,但不出现G′-G″交点[15]。SPI热致凝胶在频率扫描过程中,G′和G″随频率增加而增加,且G′一直高于G″,对频率具有较大的依赖性,SPI热致凝胶主要通过非共价键(疏水相互作用和氢键)进行交联形成网状结构,属于物理型凝胶。虽然中功率超声处理可以提高SPI热致凝胶的黏弹性,降低tanδ,但tanδ始终大于0.1,仍属于弱凝胶的范畴[33]。

3 结论

超声波可以改变SPI分散液的流变特性,降低G′、G″和表观黏度,其黏弹结构发生改变,使SPI分散液更接近于类液体的特性。400和600 W超声处理可以引起部分蛋白颗粒的重聚集,从而使SPI分散液表现出微弱凝胶的状态。超声波对SPI热致凝胶特性的影响结果表明,中功率超声处理可以改变SPI黏弹结构,为凝胶形成提供更多的作用位点,从而加速凝胶形成,提高其凝胶强度和凝胶结构的稳定性。本研究说明一定强度的超声处理可以改善蛋白质的凝胶特性,但需要限制超声强度,低功率和高功率的作用下,蛋白质的凝胶特性可能会降低。超声处理作为一种物理改性的手段,可以增强SPI的凝胶性能和改善胶凝能力。但如果仅仅依靠超声波这一种手段,改善蛋白凝胶特性的效果是有限的,SPI凝胶仍未突破弱凝胶的范围。为了进一步提高超声波处理的效果,未来的研究应集中在利用超声波技术与其他技术相结合的方式进行改性SPI,以期待获得更强改善其功能特性的效果。