张芳雅,包海鹰,图力古尔

(吉林农业大学,食药用菌教育部工程研究中心,吉林长春 130118)

水皮子蘑菇为口蘑科(Tricholimataceae)杯伞属(Clitocybe)真菌落叶杯伞(Clitocybephyllophila(Pers.)P. Kumm.)。水皮子蘑菇是山西省五台山传统食用菌。据《五台县志》记载,五台山蘑菇,号称“台蘑”,资源丰富,是山西著名特产之一[1]。台蘑包含许多重要的食药用菌[2],李时珍的《本草纲目》中记载台蘑具有益气、杀虫的作用[3]。山西著名方剂舒筋散就是以台蘑作为主药,具有舒筋活血、追风散寒等作用[4]。水皮子蘑菇是台蘑的一种[5],在当地又被称为“水银盘”,因其独特的气味和口感,广受当地人民和游客的喜爱。

该菌在当地食用历史悠久[6],研究人员已对该菌做了相关分类学的研究,但对其化学成分的研究尚属空白。目前从大型真菌中提取天然化合物的主要方法是乙醇浸提法和连续回流提取法,乙醇浸提法提取时间过长所需提取试剂量大,连续回流提取法较前者所需时间短[7-8]。因此采用连续回流法进行提取,通过色谱分离技术与波谱分析技术等方法,研究水皮子蘑菇的化学成分。以期了解该食用菌主要化学成分并得到其中的功能性单体化合物,从而更合理的开发该野生食用菌的价值,为台蘑的广泛及深度利用提供参考和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水皮子蘑菇 采自山西五台山野外;石油醚、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷等试剂 均为分析纯,北京化工厂;柱色谱硅胶 200～300目,青岛海洋化工有限公司;Sephadex LH-20(葡聚糖凝胶 LH-20) 北京索莱宝科技有限公司。

Bruker-500M AVIII核磁共振波谱仪 瑞士布鲁克公司;Finnigan-MAT LCQ 质谱仪 美国Finnigan公司;CP214型电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;X-6显微熔点测定仪 北京泰克仪器厂;Eyela-N-1200B旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司;Eyela-OSB-2100油浴锅 上海爱朗仪器有限公司;Eyela-A-1000S水流抽气机 上海爱朗仪器有限公司

1.2 实验方法

1.2.1 化学成分的提取和分离 将采集到的新鲜水皮子蘑菇子实体置于阳光下曝晒干燥,获得干燥子实体1.02 kg,粉碎,过4目筛,置于5 L的圆底烧瓶中,采用连续回流的提取方法。依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇各5000 mL,提取温度分别为65、40、78、65 ℃,连续回流提取10 h,重复提取3次,合并滤液,减压回收溶剂,获得石油醚层浸膏10.03 g,二氯甲烷层浸膏6.30 g,乙酸乙酯层浸膏8.65 g,甲醇层浸膏112.20 g。

对获得的浸膏采用正向硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、制备薄层色谱板等方法进行单体化合物的分离。采用湿法装柱,干法上样的分离方法,硅胶装柱量为上样量的60倍。石油醚浸膏经正向硅胶柱色谱,石油醚-乙酸乙酯系统(300∶1～1∶1)梯度洗脱,每200 mL收集一个流分,经薄层硅胶板检测,合并相同流分,共得6个流分,其中流分4以石油醚-乙酸乙酯(100∶1～1∶1)洗脱得到化合物1,流分6以石油醚-乙酸乙酯(85∶1～1∶1)梯度洗脱,重结晶得到化合物2。二氯甲烷浸膏经石油醚-乙酸乙酯系统(200∶1～1∶1)梯度洗脱,每150 mL收集一个流分,经薄层硅胶板检测,合并相同流分,获得7个流分,其中流分4以石油醚-乙酸乙酯(70∶1～1∶1)洗脱得到化合物3,流分5经过石油醚-乙酸乙酯(60∶1～1∶1-乙酸乙酯)洗脱得到化合物4。乙酸乙酯层浸膏经正向硅胶柱,二氯甲烷∶甲醇(150∶1～1∶1)梯度洗脱获得11个流分,流分9以二氯甲烷-甲醇(85∶1～1∶1)梯度洗脱得到化合物5和6,流分10以二氯甲烷-甲醇(50∶1～1∶1)梯度洗脱和制备薄层色谱板分离得到化合物7和8。甲醇层浸膏经甲醇溶解后,使用等体积环己烷萃取,萃取后使用色谱柱以二氯甲烷-甲醇洗脱系统(100∶1～1∶1-甲醇)梯度洗脱得5个流分,其中流分2经制备色谱板分离,回收,洗脱,重结晶得化合物9,流分5以二氯甲烷-甲醇(75∶1～1∶1)梯度洗脱得化合物10。

1.2.2 化学成分的鉴定

1.2.2.1 熔点的测定 采用微量熔点测定法,对所获得的化合物分别取微量结晶,置于玻片上并盖上盖玻片,放在加热台上,调节显微测定仪使显微镜焦点对准样品后,开启加热器,控制升温速度先快后慢,记录测定所得熔点温度数据[9]。

1.2.2.2 质谱分析 取少量待测化合物,分别用甲醇溶解,通过质谱仪对其进行分析,进样量流速设置为120 μL/h,以高纯氮气作为雾化气和干燥气,喷雾气压力为5 psi,干燥气流速为5.0 L/min,干燥温度为220 ℃,质荷比范围设置为50～1000 m/z[10]。

1.2.2.3 核磁共振分析 取适量分离得到的化合物,分别用氘代氯仿溶解后置于核磁管中,使用Bruker-500M AVIII核磁共振波谱仪进行测定,一维氢谱测定条件为500 MHz,一维碳谱测定条件为125 MHz[11]。

1.3 数据处理

运用MestReNova 12.0.0对获得的核磁谱数据进行解析。运用ChemDraw Ultra 7.0对得到的化合物绘制化学结构式。

2 结果与分析

2.1 提取物中各组分的分离结果

通过硅胶柱色谱及制备薄层板等分离方法并结合薄层色谱检测分析,从石油醚层提取物中分离纯化得到化合物1(43 mg)、化合物2(19 mg)。二氯甲烷层提取物中分离纯化得到化合物3(21 mg)、化合物4(32 mg)。乙酸乙酯层提取物中分离纯化得到化合物5(16 mg)、化合物6(22 mg)、化合物7(35 mg)、化合物8(19 mg)。甲醇层提取物中分离纯化得到化合物9(18 mg)、化合物10(20 mg)。

2.2 化合物的结构鉴定

2.2.1 化合物1的结构鉴定 具有特殊的芳香气味,为无色油状物质,易溶于乙酸乙酯、乙醇等,EI-MS m/z:277[M]+,分子量为278,分子式为C16H22O4。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.88(6H,t,J=7.1 Hz,H-11,16),1.39(4H,h,J=7.1 Hz,H-9,10),1.70(4H,q,J=7.1 Hz,H-9,14),4.21(4H,t,J=7.1 Hz,H-13,15),7.71(2H,J=1.3 Hz,H-4,5),7.76(2H,ddd,J=7.8,1.3,0.5 Hz,H-3,6);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:167.69(C-7),132.31(C-1),129.39(C-4),129.32(C-3),65.45(C-8),30.64(C-9),19.30(C-10),13.85(C-11)。以上数据与文献[12]报道一致,因此鉴定化合物1为邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate),化学结构式如图1。

图1 化合物1的化学结构式Fig.1 Chemical structure of compound 1

2.2.2 化合物2的结构鉴定 白色粉末样固体,易溶于二氯甲烷、甲醇等,不溶于水,mp:62～64 ℃,EI-MS m/z:256[M]+,分子量为256,分子式为C16H32O2。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.88(3H,t,J=6.8 Hz,H-1),1.26(24H,m,H-2～13),1.63(2H,m,H-14),2.34(2H,t,J=7.5 Hz,H-15)。13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:180.14(C=O),34.06(C-15),31.92(C-3),29.68(C-5),29.66(C-6),29.65(C-7),29.65(C-8),29.63(C-9),29.58(C-10),29.43(C-4),29.35(C-11),29.23(C-12),29.06(C-13),24.68(C-14),22.68(C-2),14.08(C-1)。以上数据与文献[13]报道一致,因此鉴定化合物2为棕榈酸(Hexadecanoic acid),化学结构式如图2。

图2 化合物2的化学结构式
Fig.2 Chemical structure of compound 2

2

4

+

28

44

1

3

13

3

图3 化合物3的化学结构式Fig.3 Chemical structure of compound 3

2.2.4 化合物4的结构鉴定 无色针状结晶,薄层色谱板用10% H2SO4显色,显深绿色,放置3 h后颜色无明显变化,mp:176～178 ℃,EI-MS m/z:428[M]+,分子量为428,分子式为C28H44O3。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.82(3H,d,J=5.2 Hz,H-27),0.84(3H,d,J=5.2 Hz,H-25),0.86(3H,s,H-18),0.92(3H,d,J=5.2Hz,H-28),0.99(3H,d,J=7.0 Hz,H-23),1.01(3H,s,H-19),3.97(1H,m,H-3),5.21(1H,dd,J=15.4Hz,H-22),5.15(1H,dd,J=15.4Hz,H-23),6.25(1H,d,J=8.2Hz,H-6),6.51(1H,d,J=8.2Hz,H-7);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:135.44(C-6),135.20(C-22),132.32(C-23),130.72(C-7),82.17(C-5),79.42(C-8),66.40(C-3),56.22(C-17),51.69(C-14),51.13(C-9),44.57(C-13),42.78(C-24),39.69(C-20),39.36(C-12),36.97(C-4),36.94(C-10),34.71(C-1),33.06(C-25),30.10(C-2),28.62(C-16),23.40(C-11),20.88(C-21),20.63(C-15),19.93(C-27),19.63(C-26),18.16(C-19),17.55(C-28),12.87(C-18)。以上数据与文献[15]报道一致,因此鉴定化合物4为麦角甾醇过氧化物(Ergosterol peroxide),化学结构式如图4。

图4 化合物4的化学结构式Fig.4 Chemical structure of compound 4

2.2.5 化合物5的结构鉴定 白色粉末样固体,易溶于二氯甲烷、甲醇等,不溶于水,mp:57～61 ℃,EI-MS m/z:284[M]+,分子量为284,分子式为C18H36O2。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.88(3H,t,J=6.9 Hz,H-1),1.26(28H,m,H2-15),1.63(2H,m,H-16),2.34(2H,t,J=7.5 Hz,H-17);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:180.45(C-COOH),34.11(C-17),31.93(C-3),29.70(C-5),29.68(C-6),29.67(C-7),29.65(C-8),29.64(C-9,10),29.59(C-11,12),29.43(C-4),29.36(C-13),29.23(C-14),29.06(C-15),24.67(C-16),22.68(C-2),14.07(C-1)。以上数据与文献[16]报道一致,故鉴定化合物5为十八烷酸(Searic acid),化学结构式如图5。

图5 化合物5的化学结构式
Fig.5 Chemical structure of compound 5

+

7

6

2

13

3

图6 化合物6的化学结构式Fig.6 Chemical structure of compound 6

2.2.7 化合物7的结构鉴定 无色针状结晶,易溶于甲醇,难溶于石油醚等极性大的溶剂,薄层板在紫外下不显色,肉眼见无色斑点,mp:132～134 ℃,分子式为CH4N2O。13C NMR(125 MHz,MeOD)δ 162.24。以上数据与文献[18]报道一致,因此鉴定化合物7为脲(Urea),化学结构式如图7。

图7 化合物7的化学结构式Fig.7 Chemical structure of compound 7

2.2.8 化合物8的结构鉴定 白色粉末,易溶于氯仿,薄层板在紫外灯365 nm下显现黄绿色斑点,mp:252～254 ℃,EI-MS m/z:433[M]+,分子量为433,分子式为C26H73O3。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:0.77(3H,s,H-18),0.80(3H,d,J=6.6 Hz,H-27),0.85(3H,d,J=6.6 Hz,H-26),0.88(3H,d,J=7.0 Hz,H-28),0.96(3H,d,J=6.8 Hz,H-21),1.18(3H,s,H-19),1.67(3H,d,J=1.5 Hz,H-29),2.15(1H,dd,J=12.8,12.1 Hz,H-4),2.39(1H,m,H-20),3.61(1H,m,H-6),3.89(1H,m,H-3),4.97(1H,d,J=1.5 Hz,H-22),5.36(1H,d,J=7.7,2.6 Hz,H-7);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:141.64(C-8),134.24(C-23),134.13(C-22),128.15(C-7),75.09(C-5),73.89(C-6),67.40(C-3),56.19(C-17),54.62(C-14),48.00(C-9),44.25(C-12),43.08(C-4),42.43(C-10),42.11(C-20),40.66(C-1),39.03(C-25),33.38(C-2),31.44(C-16),28.28(C-11),27.71(C-15),23.11(C-27),20.41(C-26),20.21(C-21),20.00(C-19),19.17(C-28),17.67(C-29),11.97(C-18)。以上数据与文献[19]报道一致,因此鉴定化合物8为麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇(Ergosta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol),化学结构式如图8。

图8 化合物8的化学结构式Fig.8 Chemical structure of compound 8

2.2.9 化合物9的结构鉴定 白色晶体,易溶于二氯甲烷,mp:249～251 ℃,EI-MS m/z:442[M]+,分子量为422,分子式为C30H50O2。1H NMR(500 MHz,CDCl3)δ:4.94(1H,s,H-29),3.66(1H,s,H-30),3.48(1H,d,J=3.3 Hz,H-2),2.67(1H,d,J=8.1 Hz,H-19),1.85(2H,t,J=7.6 Hz,H-21),1.26(H,s,H-13),1.58(3H,s,H-28),1.01(3H,s,H-26),0.95(3H,s,H-23),0.86(3H,s,H-25);13C NMR(125 MHz,CDCl3)δ:153.18(C-20),114.30(C-29),82.43(C-3),69.27(C-28),59.34(C-5),53.97(C-9),50.94(C-18),50.55(C-19),50.47(C-17),45.83(C-14),44.19(C-4),42.86(C-8),42.36(C-1),40.97(C-13),39.92(C-10),37.71(C-22),35.59(C-7),33.08(C-21),31.62(C-16),30.93(C-23),28.55(C-2),26.40(C-12),23.88(C-15),23.63(C-11),22.63(C-6),21.17(C-25),20.56(C-24),18.87(C-26),15.96(C-27)。以上数据与文献[20]报道一致,因此鉴定化学物9为白桦脂醇(Betulin),化学结构式如图9。

图9 化合物9的化学结构式Fig.9 Chemical structure of compound 9

2.2.10 化合物10的结构鉴定 无色针状晶体,不易溶于石油醚,二氯甲烷等,mp:231～233 ℃,EI-MS m/z:123[M]+,分子量为123,分子式为 C6H5NO2。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:9.08(1H,d,J=1.5 Hz,H-2),8.79(1H,dd,J=4.8,1.7 Hz,H-6),8.27(1H,dt,J=7.9,1.9 Hz,H-4),7.54(1H,m,H-5);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:166.71(C-COOH),153.71(C-2),150.66(C-6),137.41(C-4),127.04(C-3),124.24(C-5)。以上数据与文献[21]报道一致,故鉴定化合物10为3-吡啶甲酸(Nicotinic acid),化学结构式如图10。

图10 化合物10的化学结构式Fig.10 Chemical structure of compound 10

3 结论

通过提取、分离及鉴定,从水皮子蘑菇中共得到10个单体化合物,分别为邻苯二甲酸二丁酯、棕榈酸、麦角甾醇、麦角甾醇过氧化物、十八烷酸、苯甲酸、脲、麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇、白桦酯醇、3-吡啶甲酸,该10种化合物均为首次从水皮子蘑菇中分离获得。其中的麦角甾醇、麦角甾醇过氧化物等广泛存在于大型真菌中,具有较强的抗肿瘤抗氧化作用[22-24],在水皮子蘑菇中的相对含量也较高;白桦脂醇是具有消炎、抗病毒、保肝等作用的天然化合物[25-28],同时具有一定的抗肿瘤作用[29-31]。白桦脂醇在栓菌中较为常见,但在杯伞中的存在较为罕见。此次从水皮子蘑菇中分离获得白桦脂醇等单体化合物,为水皮子蘑菇进一步进行药理研究及功能性食品的开发提供理论基础。经过对水皮子蘑菇化学成分提取分离,对其作为台蘑的推广提供理论依据,有助于该食用菌更进一步的开发利用与深入研究。