张国华,吴光斌,陈昭华,张 珅,陈发河

(集美大学食品与生物工程学院,福建厦门 361021)

莲雾(Syzygiumsamarangenese[Blume]Merrill & L.M. Perry)又名洋浦桃、水蒲桃、爪哇浦桃等,属桃金娘科蒲桃属乔本植物,起源于马来半岛、安达曼和尼科巴群岛[1]。早在17世纪就引种到台湾,目前在中国福建、广东、海南等多地均有栽培[2-3]。莲雾果实营养丰富,风味独特,鲜食生津解渴,亦可加工成果汁和罐头食品[4-6]。但是由于莲雾果实组织幼嫩疏松、生命活动旺盛,采后如不及时处理容易发生果肉絮状绵软症状,食用品质急剧下降,失去商用价值[7-8]。

氨基酸作为蛋白质的分解产物是评价食品质量及营养价值的重要指标[9-11]。目前氨基酸的分析方法有很多种,主要包括氨基酸自动分析仪、高效液相色谱法、毛细管电泳法、气相色谱法等[12],其中以柱前衍生高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法测定游离氨基酸最为广泛,具有灵敏度高、重复性好,操作费用较低等优点[13]。常用的衍生试剂有:邻苯二甲醛(OPA)[14]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[15]、芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)[16]、乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(DEEMM)[17]和异硫氰酸苯酯(PITC)等[18]。在这些衍生试剂中,PITC与氨基酸的反应迅速、产物单一稳定、衍生后易除去多余的试剂且不会影响检测灵敏度,已成为一种经典的氨基酸衍生方法,已广泛用于检测黄酒[19]、西瓜[20]、青豆[21]和食用海藻[22]中的氨基酸。目前利用HPLC检测莲雾果实中的游离氨基酸的研究甚少,本文建立了一种柱前衍生化高效液相色谱同时测定莲雾果实中15种游离氨基酸的方法,以期为今后莲雾果实游离氨基酸含量的测定研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

台湾“蜜风铃”莲雾(Syzygiumsamarangenese[Blume]Merrill & L.M. Perry) 购于厦门中埔台湾水果集散中心,挑选大小适中、表皮颜色和成熟度一致且无损伤的果实,在温度(4±0.5) ℃,湿度85%±2%的条件下进行贮藏;15种氨基酸对照品(L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-酪氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸和L-赖氨酸) 纯度均≥98%,北京索莱宝科技有限公司;异硫氰酸苯酯、三乙胺、三水合乙酸钠 均为色谱纯,上海麦克林生化科技有限公司;乙腈 色谱纯,Sigma-Aldrich公司。

Agilent 1260型高效液相色谱仪 美国Agilent公司;MS3 digitial旋涡振荡器 德国IKA公司;Quintix®分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;PE20K型pH计 梅特勒-托利多仪器;GL-20G-II-D离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 单一标准储备液:用0.1 mol/L盐酸配制质量浓度为500 mg/L的15种氨基酸标准溶液,4 ℃保存。混合标准工作液:分别移取适量的各单一标准储备液,用0.1 mol/L盐酸稀释成2、10、50、100、250、500 mg/L配成混合标准溶液,待衍生化。

1.2.2 样品提取 取10 g新鲜莲雾果肉样品,加入15 mL超纯水,4 ℃超声(400 W,40 kHz)30 min,再加入15 mL 80%乙醇,4 ℃过夜后,10000 r/min离心20 min,水温38 ℃以下,减压蒸馏出去乙醇,待样品成糊状时,逐渐减压取出烧瓶,在剩余物中加入5 mL乙醚,用分液漏斗反复抽提两次,抽提后收集水层,用0.1 mol/L盐酸定容至5 mL,制得样品提取液,待衍生化。

1.2.3 衍生化操作 准确吸取样液/标液1 mL于10 mL离心管中,分别加入14%三乙胺-乙腈溶液和1.2% PITC-乙腈溶液各0.5 mL,涡旋10 s,室温静置30 min,加入2 mL正己烷,漩涡60 s,室温静置10 min,10000 r/min,离心5 min,弃去上清。再次加入2 mL正己烷重复后续操作,取下层清液经0.45 μm有机滤膜过滤后上HPLC进行分析。

1.2.4 色谱条件 色谱柱:Atlantis T3柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相A:0.1 mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.5,含0.5%三乙胺);流动性B:乙腈-水(4∶1);流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:35 ℃;进样量:20 μL;洗脱程序为:0～3 min,100% A;15～20 min,85% A;25 min,80% A;30～35 min,75% A;40 min,70% A;45 min,60% A;50 min,20% A;55 min,10% A;56～60 min,0% A;61～70 min,100% A。

1.3 数据处理

使用Microsoft Excel 2016软件对数据进行处理,使用Adobe Photoshop软件对图像进行处理。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

考察了InfinityLab Poroahell C18柱(4.6 mm×150 mm,4 μm)和Atlantis T3(4.6 mm×250 mm,5 μm)在乙酸钠水溶液(pH=6.5,A)和乙腈-水(4∶1,B)梯度洗脱条件下的分离效果。结果如图1显示,Atlantis T3色谱柱具有良好的分离效果,15种氨基酸的分离度均大于1.5。因此实验选用Atlantis T3色谱柱。

图1 混合氨基酸标准品在InfinityLab Poroahell C18柱(A)及Atlantis T3柱(B)中的液相色谱图Fig.1 The chromatogram of 15 amino acids onInfinityab Poroahell C18(A)and Atlantis T3(B)columns注:1:天冬氨酸;2:谷氨酸;3:组氨酸;4:精氨酸;5:苏氨酸;6:丙氨酸;7:脯氨酸;8:酪氨酸;9:缬氨酸;10:甲硫氨酸;11:异亮氨酸;12:亮氨酸;13:半胱氨酸;14:苯丙氨酸;15:赖氨酸,图2～图3同。

2.2 流动相体系的选择

PITC柱前衍生液相色谱法测定氨基酸常采用乙腈-水和0.1 mol/L乙酸钠水溶液作为流动相。本实验比较了在乙酸钠水溶液中添加0.5%三乙胺和不添加三乙胺对峰型的影响,结果如图2和图1B显示,添加三乙胺后各组分的色谱峰形得到明显的改善。实验中还进一步考察了乙酸钠水溶液的pH为6.2、6.3、6.4、6.5对氨基酸保留时间及分离度的影响,结果显示,当pH为6.5时,分离度和峰型最为理想。因此,本实验最终选用0.1 mol/L乙酸钠(pH6.5,含0.5%三乙胺)和乙腈-水(4∶1)作为流动相进行洗脱。

本实验首先采用的是等度洗脱的方式,结果发现目标成分很难有效分离,改用梯度洗脱的方式后有较大的改善,当浓度梯度为0～3 min,100% A;15～20 min,85% A;25 min,80% A;30～35 min,75% A;40 min,70% A;45 min,60% A;50 min,20% A;55 min,10% A;56～60 min,0% A;61～70 min,100% A条件时,15种氨基酸能有效分离,满足实验要求。在前述优化的色谱条件下对标准品和样品进行测定,15种氨基酸混合标准品及莲雾样品的液相色谱图见图3。

2.3 标准曲线、线性范围和检出限测定结果

在优化的实验条件下,以混合标准工作液的浓度为横坐标(x),其衍生物峰面积为纵坐标(y),绘制标准曲线,根据信噪比(S/N=3)和(S/N=10)分别确定检出限(LODs)以及定量限(LOQs)。结果见表1,15种氨基酸标准品呈现良好的线性关系,相关系数范围为0.9954～0.9996,检出限为0.08～0.35 mg/L,定量限为0.35～1.25 mg/L。

表1 15种氨基酸的标准曲线、相关系数、检出限和定量限Table 1 Regression equations,correlation coefficients,limits of detection(LODs)and limits of quantification(LOQs)for 15 amino acids

图2 流动相添加三乙胺的液相色谱图Fig.2 Liquid chromatogram of triethylamine in mobile phase

图3 15种氨基酸混合标准品(A)及莲雾样品(B)的液相色谱图Fig.3 The chromatogram of 15 aminoacids(A)and wax apple sample(B)

2.4 回收率和精密度测定结果

为了验证方法的准确度,通过向莲雾果实样品中加标以测定各组分的回收率,加标水平按本底值的约0.5(a)、1.0(b)和1.5(c)倍添加,按照1.2.2进行处理。每个加标水平平行测定6次,计算平均加标回收率和相对标准偏差(RSD),见表2。结果显示,各组分的平均加标回收率为85.61%～106.68%,RSD均小于5%,说明该方法精密度良好,准确度高。

表2 15种氨基酸在莲雾样品中的加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 2 Average recoveries and RSD of 15 amino acids in wax apple samples(n=6)

2.5 样品测定

表3 莲雾果实中15种游离氨基酸的含量(n=3)Table 3 The content of 15 amino acids in wax apple(n=3)

采用上述优化的试验方法,对莲雾果实中的游离氨基酸含量进行测定,结果见表3。在莲雾果实中共检测到12种游离氨基酸,包含有7种人体必需氨基酸和2种儿童必需氨基酸。相关研究表明,不同水果中游离氨基酸的含量不尽相同,荔枝中γ-氨基丁酸含量较高,香蕉中苏氨酸和丝氨酸含量较高,百香果中脯氨酸含量较高[23]。而在莲雾果实中苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、缬氨酸和精氨酸含量较高,每种水果中所含有的各种游离氨基酸比例不同,可为开发不同功能食品提供基础的数据参考。氨基酸作为生物体内蛋白质分子的基本组成单位,与人体生命活动密切相关。其中,苯丙氨酸可参与消除肾及膀胱功能的损耗;脯氨酸与血红蛋白密切相关;缬氨酸可作用于黄体、乳腺及卵巢;精氨酸不仅具有促进胰岛素生成及分泌的作用,还有助于生长发育和创口愈合[24];赖氨酸不仅可以调节人体代谢平衡,促进儿童智力的发育,还能防止细胞退化;异亮氨酸可参与胸腺、脾脏及脑下腺的调节以及代谢;亮氨酸可参与平衡异亮氨酸;谷氨酸具有生成红细胞、改善脑细胞营养的作用,是治疗神经衰弱和记忆力减退的有效成分[25]。

3 结论

本实验构建了PITC柱前衍生高效液相色谱法测定莲雾果实中15种游离氨基酸含量的方法,该方法15种氨基酸能有效分离,各氨基酸组分的线性范围较宽,在2～500 mg/L范围内呈现良好的线性关系,检出限为0.08～0.35 mg/L,定量限为0.35～1.25 mg/L,加标回收率为85.61%～106.68%,RSD均小于5%,说明方法精密度好,准确度高,适用于莲雾果实游离氨基酸含量的分析。