王文珺,叶升锋,谢艳红,叶 金,刘学英,王松雪,李 俊,桑华春,*

(1.北京智云达科技股份有限公司,北京 100085; 2.湖南工业大学生命科学与化学学院,湖南株洲 412007; 3.北京众检四方检验检测技术有限公司,北京 102200; 4.国家粮食和物资储备局科学研究院,北京 100037; 5.中国农业科学院饲料研究所,北京 100081)

粮食中的农药残留,既来源于田间喷洒的农药,也来源于粮食储运过程中使用的化学药剂,此外,地下水及土壤的农药污染也会迁移到粮食中[1]。有机磷类农药是目前粮食生产存储过程中广泛并大量使用的杀虫剂,其残留严重危害人、畜及环境安全[2]。有机磷类农药具有种类多、毒性差异大、化学性质不稳定、检测难度大等特点[3],检测方法主要有气相色谱(Gas Chromatography,GC)、液相色谱(Liquid Chromatography,LC)、气相色谱-质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)、液相色谱-质谱联用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS)等大型仪器分析方法[4-6]和酶抑制法(分光光度法)[7-9]等。仪器分析方法检测结果准确、灵敏,但检测成本高、费时、对技术人员的专业要求高、适合实验室分析;而酶抑制法具有操作简便、快速、满足现场检测等优点,所以《GB/T 5009.199-2003 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测》[10]等一系列国家标准、农业行业标准都推荐了酶抑制法。但目前酶抑制法的研究和应用对象主要是蔬菜、水果中农药残留的检测,在粮食中的应用较少[7,11]。而且常规酶抑制法因准确性及灵敏度等问题,多年来一直存在争议[12]。对有机磷农药来说,酶抑制法的检出限常常无法达到我国粮谷的国家安全限量,其主要技术原因是硫代磷酸酯类农药对胆碱酯酶的不敏感[13]。事实上,有机磷类农药分为磷酸酯类和硫代磷酸酯类两大类,其中相当一部分属于硫代磷酸酯类农药,这就导致了酶抑制法对有机磷农药的检出率低[14]。

胆碱酯酶是酶抑制法应用的基础,其灵敏度、特异性及稳定性直接影响了检测结果的准确度,因此选择合适的酶一直是酶抑制法研究的热点[15-17]。人们常采用乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase,AChE)作为催化酶,但硫代磷酸酯类农药对AChE催化水解功能的抑制效果较差,因此常因灵敏度低而出现漏检的情况。为提高有机磷的检出率,本研究对酶抑制法进行了改良,选择对有机磷农药抑制效果较好的丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase,BChE)作为研究对象;使用氧化剂溴代琥珀酰亚胺作为增强剂,以提高检测灵敏度,实现对粮谷中有机磷农药的有效检测，以期为我国粮食质量安全监管提供有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

谷物(包括稻谷、小麦、玉米、糙米、杂粮等)阴性样品 参照《GB/T 5009.20-2003食品中有机磷农药残留量的测定》[18],粮食样品经气相色谱法检测,没有检出待测有机磷农药残留的样品，样品来源于北京华联超市、北京物美超市及社区农贸市场等；辛硫磷(phoxim)、对硫磷(parathion)、毒死蜱(chlorpyrifos)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、马拉硫磷(malathion)、杀螟硫磷(fenitrothion)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、三唑磷(triazophos)、乙硫磷(ethion)等有机磷农药标准溶液 购自北京坛墨质检科技有限公司;乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、维生素C(还原剂) 购自sigma公司;溴代琥珀酰亚胺、5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、碘化乙酰硫代胆碱、碘化丁酰硫代胆碱 购自Fluka公司;磷酸二氢钾(KH2PO4)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、碳酸氢钠(NaHCO3)、无水乙醇(CH3CH2OH)等 均是分析纯试剂,购自国药集团化学试剂有限公司。

ZYD-NP12A农药残留快速检测仪 北京智云达科技股份有限公司;Millpore-Q超纯水仪 美国Millipore公司;DCY08-1样品浓缩仪 常州金昌实验仪器厂;DM 0412大龙兴创离心机 北京大龙兴创实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制 0.02 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH8.0):分别称取11.9 g无水磷酸氢二钠、3.2 g磷酸二氢钾和1.6 g NaCl,充分溶解于1000 mL去离子水中。

显色剂:分别称取160 mg 5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和15.6 mg碳酸氢钠,于20 mL PBS缓冲溶液中充分溶解,4 ℃保存。

底物溶液:称取125 mg碘化乙酰硫代胆碱(或137 mg碘化丁酰硫代胆碱),用15 mL去离子水充分溶解后,置4 ℃冰箱保存备用。

农药标准品:用甲醇溶解配制有机磷农药(包括辛硫磷、对硫磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、马拉硫磷、杀螟硫磷、甲基嘧啶磷、三唑磷、乙硫磷)的母液,浓度为100 μg/mL。使用时,进一步稀释母液;如果标准品溶液用以直接检测,则用水稀释,用于加标实验,则用甲醇稀释。标准品用于建立标准曲线,即农药浓度与酶抑制率关系。

1.2.2 样品前处理 将谷物(稻谷、小麦、玉米、糙米、杂粮)样品粉碎后过20目筛,混匀。称取(2.0±0.1) g样品于10 mL离心管中,加6 mL无水乙醇,涡旋2 min,4000 r/min离心5 min。

1.2.3 样品检测 取0.25 mL上清液于10 mL离心管中,在60 ℃下氮气吹干,加入3 mL PB缓冲液和50 μL增强剂,充分混匀后静置5 min,再加入40 μL还原剂,混匀。若此时溶液比较浑浊,4000 r/min离心5 min,取上清液用于检测。

根据检测样本数量,准备5 mL离心管,增加一个对照管。每管先加入50 μL胆碱酯酶,接着样品管中加入2.2 mL样品液,对照管中加入同样量的提取剂。然后再分别加入70 μL显色剂,混匀后静置反应10 min后,加入70 μL底物液,立即转移到比色皿中,放入农药残留检测仪相应的检测通道,采集3 min后吸光度变化值,由农残仪自动得出样本的抑制率。

抑制率I(inhibition rate)=(ΔA0-ΔA)/ΔA0

其中:ΔA0是对照样本反应3 min后吸光度变化值,ΔA是待测样本反应3 min后吸光度变化值。当抑制率等于50%时(IC50),检测样品中农药的浓度即为检测限。

1.2.4 提取溶剂的选择 对比分别使用PBS、乙醇和乙酸乙酯作为样品提取溶剂的提取效果。使用乙酰胆碱酯酶作为水解酶,比较在小麦、大米阴性样品中添加有机磷农药马拉硫磷、杀螟硫磷、乙硫磷和辛硫磷,在酶活性被50%抑制时(检测限)使用农药的浓度,选择适合的提取剂。

表2 硫代磷酸脂类农药对不同胆碱酯酶抑制率的影响Table 2 The inhibition rate changes of the dithiophosphate pesticides using different enzymes

1.2.5 胆碱酯酶的选择 在大米和小麦阴性样本中,分别添加不同浓度的辛硫磷、乙硫磷、杀螟硫磷和毒死蜱,以乙醇为提取溶剂,检测有机磷农药对乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BChE)的抑制情况,根据抑制率和稳定性,选择催化效果好的水解酶用于后续研究。

1.2.6 增强剂的选择 使用溴代琥珀酰亚胺作为增强剂,对比不使用增强剂时,两者灵敏度的差异。灵敏度和检测限的差别在于:灵敏度针对标准溶液而言的,检测限是针对检测样本。

1.2.7 标准曲线的建立 使用不同浓度梯度的标准品溶液,建立标准曲线。采用Origin 8.5 软件进行标准曲线的绘制,建立四参数回归方程。

1.3 数据分析

由1.2.3得到的抑制率,可以实现对待测样品农药残留的定性分析,但如果希望得到定量检测结果,就需要做进一步的数据分析。本研究采用软件Origin 8.5绘制标准曲线回归方程如下:

其中:Y为抑制率,X为农药浓度,A1代表检测范围内最低检测浓度有机磷农药的抑制率,A2是检测范围内最高检测浓度有机磷农药的抑制率,P为曲线拐点的斜率,X0为IC50。

2 结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

样品的前处理是酶抑制反应的关键步骤,选择合适的提取溶剂,可以有效提取待测农药,避免提取过程中破坏待测物的化学结构或酶的活性。本研究通过对PBS、乙醇和乙酸乙酯提取有机磷农药的效果进行分析,得到的方法检测限如表1所示。一般来说,固定其他条件,检测限值越低说明提取效果越好,即使用的提取溶剂效果最佳。使用乙醇作为提取剂,不同农药的检测限的范围为0.2～8.1 mg/kg,明显低于使用PBS和乙酸乙酯的检测限:1.2～22.4和0.8～16.8 mg/kg,因此,在后续研究中使用乙醇作为提取剂。

表1 不同提取溶剂的比较Table 1 The comparison of the different extraction methods

2.2 胆碱酯酶的选择

一般认为,有机磷类农药可与胆碱酯酶(ChE)酯解部位丝氨酸的羟基共价结合,形成了磷酰化胆碱酯酶,降低了ChE酶促水解底物的能力,从而达到了抑制酶活性的效果[16]。本研究对ChE受有机磷农药抑制的效果进行分析,包括苍蝇头部提取的乙酰胆碱酯酶(AChE)和马血清提取的丁酰胆碱酯酶(BChE),BChE在结构上与AChE类似,但BChE对底物的特异性和抑制的敏感性与AChE不同。本研究根据粮食生产存储中使用农药的种类,在阴性粮食样本中添加不同浓度的常用有机磷农药。由表2可知,不同浓度的有机磷农药对BChE的抑制率范围是33.8%±2.5%～96.1%±1.4%,稳定性范围(变异系数)是1.5%～8.1%,而对应浓度的有机磷农药对AChE的抑制率范围是15.7%±2.2%～67.9%±4.3%,稳定性范围是6.3%～14.2%。显然,有机磷农药对BChE的抑制率和稳定性都明显优于AChE,所以在后续研究中使用BChE作为水解酶。

表4 硫代磷酸脂类农药的曲线方程和决定系数Table 4 Common organphosphorus pesticides curve equation and determination coefficient

2.3 增强剂对硫代磷酸脂类农药抑制效果

增强剂在酶抑制法中起到了强氧化剂的作用,最初人们利用氯化物的氧化性作为增强剂[19],但现在趋向使用安全性较高的溴化物作为增强剂。硫代磷酸脂类农药经增强剂氧化后,其中的P=S基团变成了对胆碱酯酶敏感的P=O基团,提高了对酶的抑制效果[20]。如表3所示,使用溴代琥珀酰亚胺作为增强剂,能明显改善硫代磷酸脂类农药对BChE的抑制,提高了检测的灵敏度。灵敏度是酶活性被50%抑制(IC50)时标准溶液中农药的浓度。

表3 硫代磷酸脂类农药用增强剂处理前后抑制率变化的比较Table 3 The inhibition rate changes of thedithiophosphate pesticides treated by enchancer

2.4 标准抑制曲线的建立

根据GB/T 5009.199-2003,当被测样品的抑制率≥50%时,可判断为阳性[10]。如图1和表4,在优化条件下,对硫磷、辛硫磷、毒死蜱和三唑磷对马血清BChE的抑制中浓度IC50(50%抑制时,有机磷农药的浓度)分别为0.01、0.11、0.16和0.03 μg/L,低于相关报道的检测限值[11],标准抑制曲线由Origin分析软件得到,决定系数(R2)>0.98,基本满足了谷物中农药残留的国家检测要求。曾有人提出参考竞争性酶联免疫,把农药残留的检测限定为IC20[21-22],以弥补酶抑制法灵敏度的不足,这一想法已在立项的粮食行业标准(LS)中得到贯彻。但在本实验中,因为使用了增强剂及选择了敏感的胆碱酯酶,IC50作为检测限已基本满足了检测要求,而且使用IC50作为检测限更稳定[23]。

表5 谷物中农药残留检测结果Table 5 The amount of pesticide residues in grains

图1 硫代磷酸脂类农药的标准抑制曲线 Fig.1 The inhibition curve of organphosphorus pesticides

2.5 粮食中有机磷农药残留检测

对北京地区不同来源的200个粮食样品进行检测,每个样品设置三个重复,检测结果与气相色谱进行比对。其中12个样本经气相色谱确证为阳性,186个样品两种检测方法都为阴性。粮食的基质比较简单,基本不含对酶有抑制作用的活性物质,由此产生假阳性的几率相对较低;但酶抑制法检测的是有机磷和氨基甲酸酯类的总量,得到的是多种农药残留的总量,如果种植和存储过程中使用了多种农药,则可能出现假阳性(如样本S76),因此,酶抑制法更适合受检样品只施用了某一种农药的情况。此外,对于少数农药来说,酶抑制法的检测限没有达到GB 2763-2019的限量要求,因此会导致假阴性的结果。比如本研究中,水胺硫磷的检测限是0.1 mg/kg,而国家安全限量0.05 mg/kg,在0.05～0.1 mg/kg范围内,检测结果容易出现假阴性(如样本S234)。由表5可见,酶抑制法检测的200份样品中,187份为阴性,13份为阳性;按照《GB/T 5009.20-2003食品中有机磷农药残留量的测定》推荐的气相色谱法检,测结果为187份为阴性,13份为阳性。两种检测方法的阴性符合率为99%,阳性符合率为85%。总体样本符合率98%,较以前的研究报道有了很大的进步[24];同时说明北京地区粮食农药残留污染情况远低于全国平均水平[11]。

3 结论

于2019年8月颁布的GB 2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》,规定了483种农药在356类食品中7107个残留限量,基本涵盖了我国已批准使用的常用农药和居民日常消费的主要农产品,其中谷物及其产品占据1/4[13]。建立有效检测粮食中有机磷类农药残留快检方法,对于粮食质量安全的管控具有重要的意义。硫代磷酸酯类农药,具有最大残留限量低、对乙酰胆碱酯酶不敏感的特点,常规酶抑制法的检出限往往达不到国家安全限量要求,甚至根本无法检出。本研究通过选择合适的样品提取体系、使用增强剂、选择对有机磷类农药敏感的丁酰胆碱酯酶等,提高了检测灵敏度,实现了对有机磷农药残留的有效、快速检测,最大程度避免了漏检。但本研究改良的方法依然无法满足全部有机磷农药的检测限要求,导致产生假阴性,后续还需要进一步优化条件,提高检出率。