魏文慧,刘小波,于长青,张晓雪,李 冰,贾鸿震

(甘肃省轻工研究院有限责任公司,甘肃兰州 730030)

原花青素(Procyanidins,OPC),又称前花青素,它是双黄酮衍生物的多酚类化合物[1],是一种国际上公认的最有效的天然抗氧化剂之一。医学研究表明,原花青素具有清除人体自由基、抗肿瘤、降血脂、预防老年痴呆等的作用[2-4]。啤酒花(HumunuslupulusL)是多年生草质蔓生藤本植物,是酿造啤酒的主要原料之一,它不仅能提供啤酒独特的香气,而且还赋予啤酒独特的口感和防腐作用,被誉为“啤酒的灵魂”[5]。我国啤酒花的种植主要分布在甘肃、新疆和宁夏等地。目前,研究发现啤酒花中有400多种化合物,其中主要包括:α-酸、β-酸、酒花油、酒花树脂和酒花多酚等[6]。啤酒花主要用于提取酒花浸膏,提取浸膏后的残渣大多被废弃,其中还含有多种有效成分未被利用,造成了资源的浪费。

目前,从植物中提取原花青素的方法多为直接浸提法,该方法不仅提取时间长,且提取率不高[7]。超声波提取是一种利用它的机械效应、空化效应和热效应,通过增大溶剂分子的运动速度和穿透力来快速有效地提取生物活性成分的提取方法[8-9]。微波提取也是一项新的辅助提取技术,在微波场中,由于微波的辐射作用下,物料细胞内部温度迅速升高,压力增大,细胞涨破,使有效成分快速被溶出,同时在萃取体系中由于基体物质的差异性选择吸收微波能，使某些组分被选择性的加热,从而被萃取出来[10-11]。超声波和微波辅助提取在不同植物原料提取原花青素中均有所应用。徐洁等[12]分别利用超声波和微波从玫瑰花中提取原花青素,提取量分别为96.94和100.81 mg/g。张佰清和陈月英等[13-14]利用微波提取技术从葡萄皮渣和树莓籽中提取原花青素,提取量分别为9.12和7.19 mg/g。超声-微波协同提取法能有效地结合超声波提取法和微波提取法的优点,具有协同有效地提高提取效率,缩短提取时间、降低能耗等优点,在天然产物提取方面应用广泛[15]。然而,目前对于超声-微波协同提取法在原花青素提取上的研究并不多见,应用该技术提取啤酒花残渣中的原花青素的方法还未见报道。

因此,本研究以啤酒花残渣为原料,利用超声-微波协同法进行原花青素的提取,研究微波功率、微波时间、乙醇浓度、料液比、浸提温度和浸提时间对原花青素提取的影响,在此基础上利用Plackett-Burnman试验设计选出对其提取量影响较大的4个因素,然后再运用响应面法优化超声-微波协同提取原花青素的最佳工艺参数,以期为啤酒花残渣的综合利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

啤酒花残渣(超临界CO2萃取残渣) 甘肃省玉门拓璞科技开发有限责任公司提供;原花青素标准品(纯度:95%) 美国Solarbio公司;甲醇(色谱纯)、甲醇、无水乙醇、石油醚(30～60 ℃)、硫酸铁铵、正丁醇、盐酸、异丙醇、甲酸 分析纯,国药集团化学试剂公司。

YC-2型索氏抽提器 上海洪纪仪器设备有限公司;HD-E804-34A型恒温鼓风干燥箱 东莞市海达仪器有限公司;CW-2000型超声-微波协同提取仪 上海新拓分析仪器科技有限公司;SHZ-D(III)型循环水真空泵 上海贝仑仪器设备有限公司;ES1035A型分析天平 厦门群隆仪器有限公司;Agilent 1260高效液相色谱 北京京科瑞达科技有限公司;KQ-2200DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 参考《食品中脂肪的测定》[16]的方法,略作修改。称取一定量的酒花残渣,利用索氏抽提法对其进行脱脂,石油醚热回流抽提1.5 h,然后将其取出放在50 ℃烘箱中烘至恒重,装入自封袋冷藏备用。

1.2.2 原花青素的提取 工艺流程:啤酒花残渣→抽提去脂→超声-微波协同提取→水浴浸提→抽滤→原花青素提取液

称取10 g去脂后的酒花残渣置于500 mL圆底烧瓶中,按照一定的料液比加入一定浓度的乙醇溶液,然后将其放在超声功率为50 W、温度为60 ℃的超声-微波协同提取仪中,设定一定的微波功率和时间对其进行超声-微波处理,处理结束后将其取出,然后再在一定温度和时间的水浴锅中进行振摇提取,提取结束后抽滤,将滤液置于容量瓶中,沉淀物再重复上述提取过程提取1次。合并两次提取液,用相应浓度的乙醇溶液定容备用。

1.2.3 单因素实验设计 在超声波功率为50 W、温度为60 ℃条件下,研究微波功率、微波时间、乙醇浓度、料液比、浸提温度、浸提时间6个因素对酒花残渣中原花青素得率的影响,每个试验重复3次。以三次提取的平均值为评价值。

1.2.3.1 微波功率 按照“1.2.2”的方法,控制微波时间为50 s,乙醇浓度60%,料液比1∶20 g/mL,浸提温度55 ℃,浸提时间1.5 h,考察微波功率(400、500、600、700、800 W)对酒花残渣中原花青素得率的影响。

1.2.3.2 微波时间 在上述优化微波功率的基础上,确定微波功率为600 W,乙醇浓度60%,料液比1∶20 g/mL,浸提温度55 ℃,浸提时间1.5 h,考察微波时间(10、30、50、70、90 s)对酒花残渣中原花青素得率的影响。

1.2.3.3 乙醇浓度 在上述优化微波功率和微波时间的基础上,确定微波功率为600 W、时间为70 s,料液比1∶20 g/mL,浸提温度55 ℃,浸提时间1.5 h,考察乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%)对酒花残渣中原花青素得率的影响。

1.2.3.4 料液比 在上述优化微波功率、微波时间和乙醇浓度的基础上,确定微波功率为600 W、时间为70 s,乙醇浓度为60%,浸提温度55 ℃,浸提时间1.5 h,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)对酒花残渣中原花青素得率的影响。

1.2.3.5 浸提温度 在上述优化微波功率、微波时间、乙醇浓度和料液比的基础上,确定微波功率600 W、时间70 s,乙醇浓度60%,料液比1∶15 g/mL,浸提时间1.5 h,考察浸提温度(25、40、55、70、85 ℃)对酒花残渣中原花青素得率的影响。

1.3.3.6 浸提时间 在上述优化微波功率、微波时间、乙醇浓度、料液比和浸提温度的基础上,确定微波功率600 W、时间70 s,乙醇浓度60%,料液比1∶15 g/mL,浸提温度55 ℃,考察浸提时间(0.5、1、1.5、2、2.5 h)对酒花残渣中原花青素得率的影响。

1.2.4 Plackett-Burman试验设计 通过Plackett-Burman试验设计可以确定因素对响应值的影响作用,筛选出对响应值有影响的因素[17-18]。本试验以原花青素含量为响应值,在单因素的基础上,利用Plackett-Burman设计来筛选微波功率、微波时间、乙醇浓度、料液比、浸提温度、浸提时间6个因素对原花青素含量的影响,为进一步的Box-Behnken试验奠定基础。试验因素及水平见表1。

表1 Plackett-Burman 试验设计因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test design

1.2.5 响应面试验设计 通过单因素试验及Plackett-Burman 试验设计的结果,筛选出对啤酒花残渣提取原花青素影响最大的4个因素,然后运用Box-Behnken试验设计进行4因素3水平的响应面试验优化。以原花青素的含量为响应值(Y),分别以微波功率(A)、微波时间(B)、乙醇浓度(C)、浸提温度(D)为自变量进行优化。Box-Behnken试验优化水平设计见表2。

表2 Box-Behnken试验设计因素及水平表Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.6 超声波、微波辅助提取原花青素 分别称取两份去脂后的试样10 g,放入500 mL圆底烧瓶中,一份进行超声波辅助提取,另一份进行微波辅助提取,提取工艺同1.2.2。超声波辅助提取和微波辅助提取条件参考超声-微波协同提取的最优提取条件进行设定。每个试验进行3次重复。

超声波提取条件:超声波功率50 W、超声温度55 ℃、超声时间76 s,乙醇浓度60%、浸提温度55 ℃、浸提时间1.0 h、料液比1∶15 g/mL。

微波提取条件:微波功率540 W、微波温度55 ℃、微波时间76 s、乙醇浓度60%、浸提温度55 ℃、浸提时间1.0 h、料液比1∶15 g/mL。

1.2.7 原花青素含量的测定

1.2.7.1 色谱条件 原花青素标准曲线制作参考《保健食品中前花青素的测定》[19]的方法,略作修改。色谱柱:Symmetry C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:水∶甲醇(色谱纯)∶异丙醇∶甲酸=73∶13∶6∶8,紫外检测器波长:525 nm,进样量:10 μL,流速:1.0 mL/min,柱温:35 ℃。

1.2.7.2 标准曲线的绘制 准确称取20.00 mg原花青素标准品,将其溶解在甲醇溶液中,配制成1 mg/mL的标准液,然后分别吸取1、2、3、4、5 mL置于5 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀。配制成梯度标准液,然后各取2 mL进行水解反应,并上高效液相色谱分析测定,水解处理方法同试样测定,以峰面积对原花青素浓度做标准曲线。

1.2.7.3 试样测定 将正丁醇与盐酸按95∶5的体积比混合后,取出15 mL置于具塞锥形瓶中,再加入0.5 mL 2%的硫酸铁铵溶液和2 mL试样溶液,混匀,置于沸水中水浴回流,精确加热40 min后,立即置于冰水中冷却,经0.45 μm膜过滤,待进高效液相色谱分析。

试样中原花青素计算公式如下:

式中:x:原花青素的含量,单位(mg/g);X1:从标准曲线中得到的原花青素,单位(mg/mL);V1:试样定容体积,单位(mL);f:稀释倍数;m:试样的体积,单位(mL);V2:提取液体积,单位(mL);M:去脂后啤酒花残渣质量，单位(g)。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 原花青素的标准曲线

以不同浓度的原花青素标准品绘制的原花青素含量与峰面积之间的标准曲线如图1所示,原花青素浓度在200～1000 μg/mL时,峰面积与原花青素浓度之间呈很好的线性关系,线性方程为y=0.2703x-9.3506(R2=0.9997,n=5),因此,在测定原花青素浓度时,将待测样品稀释到一定的浓度,用此方法在相同条件下测定原花青素的出峰面积,通过出峰面积计算原花青素的含量。

图1 原花青素标准曲线Fig.1 Procyanidins standard curve

图2 微波功率对原花青素提取量的影响Fig.2 Effect of microwave power on the yield of procyanidins注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05);图3～图7同。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 微波功率对原花青素提取量的影响 图2反映的是微波功率对啤酒花残渣中原花青素提取量的影响,从图2中可以看出,微波功率在400～600 W之间时,随着功率的增加,酒花残渣中原花青素的提取量逐渐增大,在功率为600 W时,提取量最大14.22 mg/g。之后随着功率的增大,原花青素提取量趋于平稳,当功率增大到800 W时,原花青素含量出现了下降的趋势,这可能是由于微波功率增大,微波产生的热效应增大,破坏了原花青素的稳定性。

2.2.2 微波时间对原花青素提取量的影响 由图3可知,当微波时间在10～70 s时,随着微波时间的延长从啤酒花残渣中提取的原花青素含量显著增大(P<0.05),在微波处理70 s时,提取液中原花青素含量最大14.66 mg/g,之后当时间延长到90 s时原花青素含量略有下降,但差异不显著(P>0.05)。这是由于微波对啤酒花残渣组织不断的破坏,使的酒花残渣中的原花青素被释放出来,故提取液中原花青素的含量逐渐增加,当微波工作一定的时间后,原花青素的溶解量已经达到了最大,微波持续工作引起溶液局部温度升高,破坏了原花青素的结构,含量下降[20]。

图3 微波时间对原花青素提取量的影响Fig.3 Effect of microwave time on the yield of procyanidins

2.2.3 乙醇浓度对原花青素提取量的影响 不同乙醇浓度对原花青素提取量的影响如图4所示,随着乙醇浓度的增加,啤酒花残渣中原花青素的提取量呈先升高后下降的趋势,当乙醇浓度在60%时,提取液中原花青素的含量最高14.59 mg/g,之后继续增大乙醇浓度,原花青素含量反而下降,这是由于原花青素含有酚羟基,具有一定的极性[21]。在提取过程中乙醇溶液作为提取剂,随着浓度的不同乙醇溶液的极性不同,进而影响对原花青素的溶解性及选择性。因此,本实验选择乙醇浓度为60%,在该浓度下原花青素的溶出量最大。

图4 乙醇浓度对原花青素提取量的影响Fig.4 Effect of ethanol concentrationon the yield of procyanidins

2.2.4 料液比对原花青素提取量的影响 料液比对原花青素提取量的影响如图5所示。随着料液比的增加,原花青素的提取量逐渐增大,当料液比达到1∶15 g/mL后,持续加大料液比,原花青素提取量变化不再显著(P>0.05)。这是由于提取剂用量是提取过程中一个很好的推动力,在提取过程中,适宜的浓度差,能够起到很好的提取效果。一般而言,提取剂用量越大,能够被提出来的物质越多,啤酒花残渣中提取原花青素实际上是一个溶质被溶剂化的过程,当扩散达到平衡点之后,如果继续增加溶剂的量,溶质的溶出量不会发生太大的变化[22]。同时,如果一味的增大溶剂的用量,对后续的过滤、浓缩和溶剂的回收会造成很大的困难,提取成本增大。由图5结果显示,当料液比达1∶15 g/mL以后,原花青素的提取量相差不大,但是料液比的增加会给后续处理带来麻烦,且过高的料液比造成了溶剂的极大浪费,因而选择料液比为1∶15 g/mL较为合适。

图5 料液比对原花青素提取量的影响Fig.5 Effect of material/liquid ratioon the yield of procyanidins

2.2.5 浸提温度对原花青素提取量的影响 当浸提温度在25～55 ℃的范围时,随着浸提温度的升高,啤酒花残渣中原花青素被提出的量越大,当浸提温度55 ℃时,原花青素提取量达到最大12.48 mg/g,之后随温度的升高,原花青素的提取量显著下降(P<0.05)(图6)。这是由于温度的升高增大了溶剂分子的布朗运动,使得溶剂扩散速度增大,从而更多的原花青素被带出来,温度55 ℃时,原花青素的溶出达到动态平衡,提取量最大,继续升高浸提温度,高温使得原花青素遭到破坏,温度越高破坏越严重[23],该研究结果与郑洪亮从红皮云杉中提取原花青素的结果一致[24]。因此,在后续的提取过程中选取55 ℃为浸提温度。

表4 Plackett-Burman试验结果方差分析表Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman test

图6 浸提温度对原花青素提取量的影响Fig.6 Effect of extraction temperatureon the yield of procyanidins

2.2.6 浸提时间对原花青素提取量的影响 如图7所示,在浸提时间0.5～1.0 h时,浸提时间对啤酒花残渣中原花青素的提取影响显著(P<0.05),当浸提时间超过1.5 h时原花青素含量变化不再显著(P>0.05),这可能是由于浸提时间较短,部分与蛋白质和纤维素结合的原花青素类物质来不及溶出[25],但是浸提时间过长,原花青素类物质稳定性较差,容易发生氧化聚合等反应,同时,啤酒花残渣中的原花青素绝大部分已经溶出。继续延长时间只会增加提取成本,同时使得原花青素发生氧化反应而分解。故认为浸提时间为1.0 h较好。

图7 浸提时间对原花青素提取量的影响Fig.7 Effect of extraction time on the yield of procyanidins

2.3 Plackett-Burman 试验结果

通过Plackett-Burman试验设计对影响啤酒花残渣中提取原花青素的因素进行显著性分析,Plackett-Burman试验设计及结果见表3,试验结果方差分析见表4。

表3 Plackett-Burman试验设计及结果Table 3 Experimental design and resultsof Plackett-Burman test

由表4 Plackett-Burman试验结果方差分析可知,试验模型极显著(P<0.01)。同时结合单因素实验及Plackett-Burman试验结果可知,微波功率(A)、微波时间(B)、乙醇浓度(C)和浸提温度(E)四个因素对啤酒花残渣中原花青素的提取影响显著(P<0.05),所以选择微波功率、微波时间、乙醇浓度和浸提温度进行响应面的优化设计试验。料液比(D)和浸提时间(F)两个因素对原花青素提取量影响不显著(P>0.05),所以在后续试验中将其固定为1∶15 g/mL和1.0 h。

表5 Box-Behnken试验设计及结果Table 5 Experimental design and results of Box-Behnken test

表6 Box-Behnken试验结果方差分析表Table 6 Analysis of variance of Box-Behnken test

2.4 Box-Behnken试验结果

2.4.1 原花青素得率试验设计及结果 利用Design-Expert 8.0对表5中的数据进行方差分析和回归分析,对试验结果进行拟合。以微波功率(A)、微波时间(B)乙醇浓度(C)和浸提时间(D)为自变量,拟合得到回归方程:

原花青素含量(mg/g)=14.38+0.25A+0.59B+0.28C+0.15D+0.36AB-0.065AC-0.070AD-0.66BC-0.23BD+0.085CD-0.50A2-1.13B2-0.70C2-1.21D2。

图8 交互作用对原花青素含量影响的响应面图Fig.8 Response surface of the effect of interaction terms on the yield of procyanidins

2.4.2 响应面交互作用分析 响应面3D曲面图反映的是两两因素之间对响应值的影响作用,其中3D曲面图越陡峭,说明两因素之间交互作用越明显。从图8可以看出微波时间和乙醇浓度、微波功率和微波时间、微波时间和浸提温度之间交互作用显著(P<0.05),其余两两因素之间交互作用不显著(P>0.05)。该结果与方差分析结果一致。

2.4.3 最优提取工艺参数及验证 通过利用Design-Expert 8.0设计分析得到的超声-微波协同提取原花青素最佳工艺为微波功率535.70 W、微波时间76.07 s、乙醇浓度60.43%、浸提温度55.35 ℃,预测原花青素含量为14.53 mg/g。考虑到实际操作,验证试验取超声波功率50 W、超声-微波处理温度55 ℃、微波功率540 W、微波时间76 s、乙醇浓度60%、浸提温度55 ℃、浸提时间1.0 h、料液比1∶15 g/mL的条件下进行。在此条件下进行3次平行试验,得到的啤酒花残渣中原花青素含量为14.68±0.33 mg/g,与预测值相差1.03%,说明模型有效。这一研究与李玉妹[26]研究的利用有机溶剂提取不同种类啤酒花中原花青素含量有所差异,这是由于啤酒花经过超临界CO2提取酒花浸膏后部分原花青素也被带走,导致了酒花残渣中原花青素含量偏低,同时在原花青素的测定方法,本研究与李玉妹[26]的研究也有所不同。

2.5 啤酒花残渣超声波、微波及超声-微波协同提取原花青素的比较

通过对超声波辅助提取、微波辅助提取及超声-微波协同提取的结果比较发现,超声-微波协同提取原花青素含量显著(P<0.05)高于单一辅助提取法提取的原花青素含量。同时还可以看出微波辅助提取效果优于超声波辅助提取,且差异显著(P<0.05),这可能是由于在该研究中所用的超声波功率较低,使得超声波没有起到很好的辅助效果,原花青素没有完全溶出,提取出的含量较低。从三种辅助提取方法的结果比较可以看出,超声-微波协同提取能够起到很好的提取效果,该辅助提取法具有一定的推广应用价值。

表7 不同辅助提取方法提取原花青素的比较Table 7 Comparison of procyanidins extractedby different extraction methods

3 结论

通过单因素实验及Plackett-Burman试验研究发现,利用超声-微波协同辅助提取原花青素时,当料液比和浸提时间达到一定的大小后,其对原花青素含量的影响差异不再显著,但在萃取过程中原花青素的含量随着微波功率、微波时间、乙醇浓度、浸提温度的增大呈先增大后降低的趋势。因此,在此基础上利用Design-Expert 8.0中的Box-Behnken试验设计进一步对超声-微波协同提取原花青素的工艺进行研究,得到了超声-微波协同仪辅助提取原花青素的最佳工艺:超声波功率50 W、超声-微波处理温度55 ℃、微波功率540 W、微波时间76 s、乙醇浓度60%、浸提温度55 ℃、浸提时间1.0 h、料液比1∶15 g/mL,在此条件下,原花青素的提取量可达到14.68 mg/g。且显著高于单另一种超声波提取或微波提取(P<0.05)。该研究可以为啤酒花残渣中提取原花青素的研究提供一定的理论参考。