陈红惠,牛念拉姆

(文山学院化学与工程学院,云南文山 663099)

底圩茶是云南省特有的历史名茶之一,其茶味绝美,种植历史悠久,因其产于广南底圩乡而得名。优良的茶树品种和得天独厚的气候环境使底圩茶形成了独特的品质,底圩茶用于制作绿茶,其茶汤色泽鲜绿,味鲜回甘,此外还有红茶、白茶、黄茶等多个品种,市场知名度高,同时底圩茶也是制取普洱茶的主要原料[1]。深入开发底圩茶产品,对于提高产品附加值具有重要意义。

底圩茶除了含有常见的茶多酚、咖啡碱等成分外,还含有大量的多糖活性物质[2]。现代研究表明,多糖能显著降低血糖,防治糖尿病,还具有抗氧化、抗肿瘤、调节机体免疫力等功效[3]。近年来,植物源性生物活性化合物及其提取物作为促进人体健康的营养保健品的需求和应用日益增加[4],因此,从植物中提取多糖越来越受到人们的重视。由于多糖具有良好水溶性,其提取方法多采用热水提取,但该方法存在耗时、能耗大、得率低等缺点。近年来,具有提取时间短、溶剂环保、产品回收率高、成本低的绿色提取技术已成为提取研究热点和方向。超声波提取法以声波产生机械效应、空穴效应破坏植物原料,可有效提高溶剂萃取率,已被广泛应用,但超声波法在底圩茶多糖提取及抗氧化性研究未见报道[5]。本研究以广南底圩茶为对象,探讨超声波辅助技术提取底圩茶的相关因素与得率的关系,利用正交试验确定底圩茶多糖超声波辅助提取的最优条件,并研究了底圩茶多糖抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

底圩茶 产于云南省广南县底圩乡;葡萄糖标准品(纯度>98%) 北京中科仪友化工技术研究院;2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(纯度>98%)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(纯度>98%)、Tris、蒽酮、硫酸、盐酸、无水乙醇、抗坏血酸、水杨酸、邻苯三酚、过氧化氢、过硫酸钾、三氯甲烷(分析纯) 南京化学试剂有限公司。

FRQ-1008HT型超声波清洗器 杭州法兰特超声波科技有限公司;RE-2000E(2L)旋转蒸发器 南通普瑞科技仪器有限公司;FC-18A真空冷冻干燥机 河北国辉实验仪器有限公司;LB-721可见分光光度计 青岛路博伟业环保科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 底圩茶样品预处理与多糖提取 将底圩茶在55 ℃下烘至恒重,粉碎过筛,置于棕色瓶内保存。准确称取一定质量底圩茶粉末,用无水乙醚进行脱脂处理,在合适的温度、料液比、超声功率、时间条件下超声提取,提取两次,结束后进行减压过滤,收集滤液并经旋转蒸发浓缩,往浓缩液中加入无水乙醇,于-4 ℃静置过夜,将醇沉物质进行离心,收集沉淀并进行真空冷冻干燥处理,得底圩茶粗多糖样品[6]。

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 原料颗粒度的确定 称取不同粒度(20、40、60、80、100目)的底圩茶粉2.0 g于三角瓶中,固定60 ℃的提取温度,600 W的超声波功率,1∶30 g/mL的料液比,90 min的超声时间条件,考察原料颗粒度与底圩茶多糖得率的关系。

1.2.2.2 料液比的确定 称取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,加入料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)蒸馏水,设置超声水浴温度60 ℃,超声波功率600 W,超声提取90 min,考察料液比与底圩茶多糖得率的关系。

1.2.2.3 超声时间的确定 称取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,固定600 W的超声波功率,60 ℃的提取温度,1∶30 g/mL的料液比条件,分别提取30、50、70、90、110 min,考察超声时间与底圩茶多糖得率的关系。

1.2.2.4 提取温度的确定 称取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,加入料液比1∶30 g/mL蒸馏水,设置超声功率600 W,改变超声水浴温度为20、30、40、50、60 ℃,在超声波提取器中提取90 min,考察提取温度与底圩茶多糖得率的关系。

1.2.2.5 超声功率的确定 称取2.0 g底圩茶粉(40目)于三角瓶中,加入料液比1∶30 g/mL蒸馏水,设置超声水浴温度为60 ℃,改变超声功率为450、525、600、675、750 W,在超声波提取器中提取90 min,考察提取温度与底圩茶多糖得率的关系[7-9]。

1.2.3 底圩茶多糖超声提取的正交优化试验 分析单因素实验结果,明确各因素间相互影响对底圩茶多糖得率的影响,多糖得率随原料粒度变化增加不明显,选择对多糖得率有显著影响的料液比、超声时间、提取温度三个因素进行正交试验[10-11],其因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 底圩茶多糖得率的测定 底圩茶多糖含量采用蒽酮-硫酸法测定[12]。标准物质为葡萄糖,于620 nm测定吸光值,绘制标准曲线。回归方程中横坐标为葡萄糖浓度(mg/mL),纵坐标为吸光值,得到方程为y=0.5033x+0.0062,决定系数R2=0.9993。根据式(1)计算底圩茶多糖得率:

式(1)

式中:c:根据标准曲线计算出的多糖质量浓度,mg/mL;v:底圩茶多糖提取液总体积,mL;m:称取的底圩茶质量,g。

1.2.5 底圩茶粗多糖的纯化 在正交实验优化条件下提取底圩茶粗多糖溶液,经旋转蒸发浓缩后往其中加入30% H2O2至糖液体积的15%,于50 ℃水浴下保温1 h,除去提取液中色素。取脱色后的底圩茶多糖粗提液,加入等体积Sevage试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1,V/V),剧烈振摇,弃去下层蛋白,重复操作5次。取脱蛋白后的水相进行流水透析48 h,将透析液进行浓缩,浓缩液中加入无水乙醇,置于-4 ℃静置过夜,离心取沉淀,用无水乙醚、丙酮反复洗涤后进行冷冻干燥,得到底圩茶多糖。称取一定质量纯化后的底圩茶多糖,用蒸馏水溶解,配制不同浓度(0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)的底圩茶多糖待测液,用于抗氧化活性测定。

1.2.6 底圩茶多糖抗氧化活性测试

式(2)

1.2.6.2 羟基自由基(·OH)清除作用 参考丁世环等[15-19]方法略作修改进行测定。分别取2.0 mL硫酸亚铁(9 mmol/L)、1.0 mL邻二氮菲溶液(0.75 mmol/L)于7支试管中,1号试管加入2.0 mL蒸馏水,从2号到7号试管依次加入0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的底圩茶多糖待测液各2.0 mL,最后每个试管再加入2.0 mL H2O2溶液(6 mmol/L),设置水浴锅温度37 ℃,放入试管保温30 min,510 nm时测定各试管的吸光值。其中,第1支试管的吸光值计为A0,第2～7支试管的吸光值计为Ax,采用同样方法,第2～7支试管中加入的过氧化氢用蒸馏水代替,测得的吸光值计为Ay,羟基自由基清除率计算公式为式(3)。

式(3)

1.2.6.3 DPPH自由基(DPPH·)清除作用 参考王丽波等[20-23]的方法进行适当修改。取0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的底圩茶多糖待测液2.0 mL于2～7号试管中,1号试管加入2.0 mL蒸馏水,在每个试管中加入2.0 mL DPPH溶液(甲醇配制,0.1 mmol/L),混合均匀后,避光30 min后测定各试管的吸光值(515 nm)。其中,第1支试管的吸光值计为A0,第2～7支试管的吸光值计为Aa,采用同样方法,第2～7支试管中加入的DPPH用甲醇代替,测得的吸光值计为Ab,DPPH自由基清除率计算公式为式(4)。

式(4)

1.2.6.4 ABTS自由基(ABTS+·)清除作用 参考闫亚美等[24-29]方法进行适当修改。取2.0 mL ABTS工作液于7支试管内,第1支加入0.5 mL蒸馏水,从2号管依次加入0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的底圩茶多糖待测液,混合均匀,10 min后测定各试管的吸光值(734 nm)。其中,第1支试管的吸光值计为A0,第2～7支试管的吸光值计为Aa,采用同样方法,第2～7支试管中加入的ABTS用甲醇代替,测得的吸光值计为Ab,ABTS自由基清除率计算公式为式(5)。

式(5)

1.3 数据处理

以上每个试验均在相同水平条件下进行3次,运用SPSS 17.0软件进行数据处理和统计分析,图形绘制采用GraphPad Prism 8.0软件。

2 结果与讨论

2.1 底圩茶多糖超声波辅助提取单因素实验

2.1.1 原料粒度对底圩茶多糖得率的影响 原料粒度大小影响提取溶剂与物料接触面积,颗粒过大,得率低,但颗粒过小,原料容易堆积结块,反而不利于溶剂渗透,提取不完全,同时也造成多糖过滤分离困难。如图1所示,40目的原料提取的多糖得率最高,为7.33%±0.19%;原料粒度增加,底圩茶多糖的得率却有所下降。因此控制原料粒度在40目左右较适宜。

图1 原料粒度对底圩茶多糖得率的影响Fig.1 Effects of granularity on yield ofpolysaccharide from Dixu tea注:不同小写字母表示显著性差异(P<0.05),图2～图5同。

2.1.2 料液比对底圩茶多糖得率的影响 在实际生产和应用中,料液比也是一个非常重要的因素。溶剂体积充足可确保样品充分浸没,有利于在提取过程中溶质的溶出。因此,本实验考虑了料液比对目标化合物多糖得率的影响。如图2所示,在试验设计的料液比范围内时,底圩茶多糖得率出现显著增加(P<0.05),但料液比大于1∶30 g/mL时,溶剂过多,会增加萃取过程的复杂性,造成不必要的浪费,此外溶剂增加对于后期多糖分离纯化效率也有较大影响,因此,从经济学角度看,原料与溶剂的比例为1∶30 g/mL比较适宜。

图2 不同料液比对底圩茶多糖得率的影响Fig.2 Effects of material-liquid ratioon yield of polysaccharide from Dixu tea

2.1.3 超声时间对底圩茶多糖得率的影响 一般来说,植物中有效成分的提取与时间有密切关系,时间短,有效成分未能充分溶解释放,时间过长,可能会造成化合物分解,降低其活性。充分的超声时间可促进多糖较好地溶解释放。如图3所示,初始时间从30 min开始,底圩茶多糖的得率明显上升,而进一步增加时间得率并未提高,反而下降,这表明90 min的超声可为原料细胞壁破裂提供充分分解时间。因此90 min为适宜的超声时间。

图3 不同超声时间对底圩茶多糖得率的影响Fig.3 Effects of ultrasonic time onyield of polysaccharide from Dixu tea

2.1.4 提取温度对底圩茶多糖得率的影响 由图4所示,当提取温度在20～50 ℃变化时,随着温度增加,多糖分子运动加快,原料在超声条件下的空化效应越明显,有利于多糖从细胞结构内部溶解析出,得率呈现显著增加趋势(P<0.05),当温度为50 ℃时,底圩茶粗多糖得率最高,为10.24%±0.12%。当温度过高,会破坏多糖的糖苷结构,引起部分多糖分解,得率会有所下降。因此,基于能耗和得率的考虑,提取底圩茶多糖的温度在50 ℃较适宜。

图4 不同提取温度对底圩茶多糖得率的影响Fig.4 Effects of ultrasonic temperatureon yield of polysaccharide from Dixu tea

2.1.5 超声功率对底圩茶多糖得率的影响 超声过程要形成较强的空化效应,需要溶剂产生合适的剪切力和进行湍流流动,这与超声功率有密切关系。如图5所示,超声功率在设计的范围内,底圩茶多糖得率水平出现显著提高(P<0.05),从7.64%±0.20%增至10.24%±0.14%。由于在超声波清洗器的最大功率750 W下,底圩茶多糖得率最高,故对其工艺优化时固定超声功率为750 W,后续不再进行考察。

图5 不同超声功率对茶多糖得率的比较Fig.5 Effects of ultrasonic poweron yield of polysaccharide from Dixu tea

2.2 正交试验结果

由表2所示,通过对底圩茶多糖得率的极差分析,影响底圩茶多糖的因素中影响最重要的因素是料液比。在正交试验设计的范围,底圩茶多糖超声波辅助提取的最佳因素水平为:A3B3C3,选择料液比为1∶40 g/mL,在提取温度60 ℃下提取110 min,可得到最高多糖得率。由表3所示,因素A(料液比)对底圩茶多糖提取影响显著(P<0.05),因素B(超声时间)、因素C(提取温度)没有显著性影响(P>0.05),在正交试验设计水平范围内,超声时间和提取温度对底圩茶多糖提取影响不大。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 正交试验方差分析Table 3 ANOVA analysis of orthogonal results

2.3 验证试验

称取40目底圩茶粉2.00 g,根据正交试验结果得到的底圩茶多糖的最优提取条件,即加入料液比1∶40 g/mL的蒸馏水,超声波功率设定为750 W,在60 ℃下进行超声提取110 min。试验进行三次重复,得到多糖平均得率为11.28%±0.49%,表明该优化工艺条件稳定,准确性高。

2.4 底圩茶多糖抗氧化活性研究

图6 底圩茶多糖对和ABTS+·的清除作用Fig.6 The scavenging effect of Diwei tea polysaccharides on 和ABTS+·

2.4.2 底圩茶多糖对·OH清除作用 羟基自由基是使生物体损伤最严重的活性氧自由基,具有穿透生物膜能力,能够严重破坏蛋白质、脂质、核酸等生物分子,引起机体发生衰老、癌症及其他疾病。·OH氧化能力极强,通过多糖对Fe2+进行螯合,可以减少·OH的产生。如图6b所示,多糖浓度由0.2 mg/mL提高至1.6 mg/mL,底圩茶多糖对·OH的清除效果增强,浓度为1.6 mg/mL时,其对·OH清除率迅速上升至83.30%±1.74%,多糖浓度高于1.6 mg/mL时,清除率增幅变小,浓度为2.0 mg/mL时,底圩茶多糖对·OH清除率为85.17%±1.70%,拟合曲线计算得到底圩茶多糖对·OH的IC50值为0.16 mg/mL,而VC的IC50值为0.03 mg/mL,说明底圩茶多糖对·OH清除能力不及VC。

2.4.3 底圩茶多糖对DPPH·清除作用 由于抗氧化物质能将紫红色的DPPH自由基还原为黄色的二苯肼。DPPH·被清除主要与抗氧化剂的供氢能力有关,常用作评价体外抗氧化试验研究的主要方法。如图6c所示,在测试的浓度范围内,底圩茶多糖均对DPPH·有明显且稳定的清除作用,底圩茶多糖浓度对DPPH·清除效果有正相关量效关系,清除率从36.99%±2.15%提高至66.48%±2.99%,拟合曲线计算得到底圩茶多糖和VC对DPPH·的IC50值分别为0.614和0.023 mg/mL。尽管底圩茶多糖与VC相比,在相同浓度下,多糖对DPPH·清除能力低于VC,但仍表现出良好的量效关系。

2.4.4 底圩茶多糖对ABTS+·清除试验 ABTS形成的水溶性自由基很稳定,一般用于抗氧化物质总抗氧化能力测定的常用指标。如图6d所示,对ABTS+·的清除试验中底圩茶多糖效果明显,在试验设计浓度范围,底圩茶多糖浓度增加,ABTS+·清除能力也随之增强,当多糖浓度为2 mg/mL时,其对ABTS+·清除率最高达82.37%±1.00%。清除率与底圩茶多糖质量浓度符合正相关关系,拟合曲线计算得到底圩茶多糖和VC对ABTS+·的IC50值分别为0.046和0.024 mg/mL,表明底圩茶多糖清除ABTS+·能力较强,清除效果与VC相近。

3 结论