曾 颖,张亚楠,曾 臻,陈仲巍,余莉莉,吴娟英

(厦门医学院,福建厦门 361023)

双水相萃取技术(aqueous two-phase extraction,ATPE)因其操作简单、条件温和、易于连续操作与扩大等特点成为近年来被广泛关注和应用的新型分离技术,且由于其系统中高达70%～80%的含水量能保护和稳定生物活性物质在分离过程中不变性和失活的这一优势[1-3],更使其能在如酶[4]、蛋白质[5]、病毒[6]、核酸[7]等生物产品[8]和天然产物[9]的提取与分离中被广泛应用。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,CE3.2.1.21)是一种能催化水解芳基和烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶,该酶对水解纤维素及合成红景天苷有重要的作用。目前关于β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在微生物[10],也有部分植物、动物和水生生物[11],提取纯化方法常采用超声波[12-13]、透析[14]、柱层析[15]等常规方法为主。有研究发现,鲍鱼内脏中含有多种消化酶[16-17],其中就含有丰富的β-葡萄糖苷酶[18-19]。鲍鱼的加工和食用主要以腹足为主,而占其总重30%左右的脏器大部分被丢弃,为提升鲍鱼内脏的应用价值,将其变废为宝,本研究选用鲍鱼内脏为原料,探索从鲍鱼内脏中萃取分离β-葡萄糖苷酶效果最佳的PEG/盐双水相体系构成,同时采用正交试验方法对其进行优化,并探究体系pH、样品加入量、超声波辅助等影响因素对萃取效果的影响,从而获得一条双水相体系分离提取鲍鱼内脏中β-葡萄糖苷酶的创新型分离提取技术路线,为目前双水相萃取技术的应用提供思路启发。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

皱纹盘鲍内脏 厦门大学海洋与地球学院提供,-20 ℃下冷冻储藏待用;对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,p-NPG) 北京索莱宝科技有限公司;对硝基苯酚、碳酸钠、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、柠檬酸、乙酸、乙酸钠、氢氧化钠(均为分析纯)、聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)600、1000、1500、2000、4000 国药集团化学试剂有限公司。

A25乳化机 上海欧河;Scientz-ⅡD超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技有限公司;3-18K高速冷冻离心机 德国Sigma;AF100制冰机 意大利斯科茨曼;Epoch 2酶标仪 美国Bio Tek。

1.2 实验方法

1.2.1 鲍鱼内脏的预处理 取一定质量的鲍鱼内脏,以1∶4的质量比加入预冷的乙酸-乙酸钠缓冲液(0.1 mol/L,pH=5.0)[18],在冰浴中用组织捣碎机匀浆后,冰浴浸提1 h后,用高速冷冻离心机离心(10000 r/min,4 ℃,15 min),取上清液(粗酶液)待用。

1.2.2 双水相体系的构建与优化

1.2.2.1 双水相体系中盐种类的确定 取4支15 mL的刻度离心管,分别加入2.5 g 40% PEG1500原液,2 g不同的盐粉末(磷酸二氢钠、硫酸铵、磷酸氢二钾、柠檬酸三钠)及1 g的粗酶液后,加水补至体系总质量为10 g,使双水相体系PEG1500的质量分数为10%,盐的质量分数为20%。充分摇匀溶解后,4 ℃下5000 r/min离心3 min,体系分相后记录上下相体积,分别取100 μL上相与下相液体,测定其酶活力和蛋白含量。

1.2.2.2 PEG/NaH2PO4相图的绘制 分别将不同分子量的PEG(600、1000、1500、2000、4000)与NaH2PO4制成一定质量分数的原液,根据参考文献[20]的方法,对不同分子量PEG/NaH2PO4体系选取一系列分相临界点,绘制双水相相图。

1.2.2.3 单因素实验 以1.2.2.1中所述方法,选取影响双水相体系萃取效果的几种主要考察因素及条件:PEG分子量(600、1000、1500、2000、4000)及不同PEG的质量分数(10%～20%范围内以2%间隔递增)和NaH2PO4的质量分数(13%～25%范围内以1%间隔递增);体系pH(2.5、3.5、4.5、5.5、6.5);粗酶液加入量(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 g)。分别测定不同双水相体系的上、下相的体积、酶活及蛋白等参数,通过对实验结果的分析与比较,探究从鲍鱼内脏中萃取分离β-葡萄糖苷酶的最佳双水相体系的构成条件及规律。

1.2.2.4 正交试验 在上述双水相体系构成的单因素实验基础上,选取影响试验的3个主要因素,在各因素选取3个最佳的水平条件,采用L9(34)正交试验表进行设计做三因素三水平正交试验,从而对1.2.2.3中的结果进行比较及验证。分别选取影响试验的3个主要因素:PEG分子量、PEG质量分数、NaH2PO4质量分数作为考察因素,各因素水平选取不仅需要在最佳水平范围内选取,还必须满足实验组均能成相,体系对β-葡萄糖苷酶萃取效果较好的3个水平条件选取见表1。

表1 双水相体系β-葡萄糖苷酶正交试验因素水平Table 1 Extraction factors and levels of orthogonaltest of the ultrasonic assisted β-glucosidase

1.2.2.5 超声波辅助提取 在制备组成相同的10 g双水相体系的步骤中,加入超声波联合处理[21-22],探究超声波辅助对双水相萃取β-葡萄糖苷酶的效果影响。实验分三组,A:PEG+粗酶液+水混匀,180 W超声处理5 min后加入NaH2PO4,混匀静置离心分相;B:NaH2PO4+粗酶液+水混匀,180 W超声处理5 min后加入PEG,混匀静置离心分相;C:PEG+NaH2PO4+粗酶液+水混匀,180 W超声处理5 min后,静置离心分相。

1.2.3 酶活力与蛋白含量的测定 采用p-NPG比色法,在403 nm处的吸光值来测定β-葡萄糖苷酶的酶活力大小[23]。酶活定义:一定条件下,1 mL酶液在1 min内水解p-NPG产生1 μmol对硝基苯酚(p-nitrophenol)定义为一个酶活力单位(U),标准曲线公式为:y=16.115x+0.0243,R2=0.999 蛋白质含量采用Brandford法进行测定[24],标准曲线公式为:y=0.435x+0.456,R2=0.998。

实验探究过程中,由于目标酶集中富集于下相,酶活的评价指标以下相为主,计算公式如下[25]:

(上)下相总酶活(U)=(上)下相酶活(U/mL)×(上)下相体积(mL)

下相酶比活(U/mg)=下相酶活(U/mL)/下相蛋白(mg/mL)

相比R=下相体积/上相体积;

分配系数K=下相总酶活/上相总酶活;

萃取率Y=(R×K)/(1+R×K)

纯化倍数PF=下相酶比活/粗酶液酶比活

1.3 数据处理

三次实验所测数据平均值及标准差采用Microsoft Office Excel 2010进行计算,并使用正交设计助手Ⅱ V3.1专业版进行正交试验设计与显著性分析。

2 结果与分析

2.1 双水相体系中盐的种类对萃取β-葡萄糖苷酶效果的影响

如图1所示,以10%PEG1500与20%的不同盐分别构建双水相体系对粗酶液进行萃取分离,NaH2PO4的酶活最高,因此后续实验选择NaH2PO4作为双水相中的盐相进行实验。

图1 不同盐种类对β-葡萄糖苷酶的萃取效果Fig.1 The effect of different types of salton extraction of β-glucosidase

2.2 PEG/NaH2PO4双水相体系总相图的绘制

分别绘制PEG600、1000、1500、2000、4000相图,合并后得总相图,如图2所示。

图2 PEG/NaH2PO4双水相相图Fig.2 Phase diagram of PEG/NaH2PO4aqueous two-phase system

相图的双节线上方是两相成相区,该区域作为选取PEG和NaH2PO4质量分数变量的依据。若只依据单一分子量的PEG相图进行单因素变量(PEG的质量分数及NaH2PO4的质量分数)实验设计,则实验的可信度不高。这是由于双水相的成相特殊性,三个因素之间存在相互间的影响及作用关系,体系的构成及最终萃取效果是在双水相成相后三者同时作用的结果,因此,1.2.2.3中单因素实验中变量的选择必须以综合相图(图2)为依据,分别对PEG600/1000/1500/2000/4000进行实验条件的选取和实验设计。2.3中的实验结果均为固定体系中PEG分子量,在其对应的PEG双节线上方(成相)区域间隔2%依次选取五个PEG质量分数为固定点,同时以该PEG双节线上成相临界点的NaH2PO4质量分数为起点,依次递增1%进行实验和比较,并从每张结果图中选取最佳的双水相体系进行重复综合验证,得到的每种PEG中最佳体系组成,最后再做综合比较,以此确定最佳的双水相体系构成。

2.3 双水相体系的构成对萃取β-葡萄糖苷酶效果的影响

2.3.1 PEG600对萃取β-葡萄糖苷酶效果的影响 分别固定PEG600的质量分数为12%、14%、16%、18%、20%,以体系刚好成相的NaH2PO4质量分数为起点,以1%的变化量依次递增NaH2PO4质量分数,选择12%为探究起点是因为当PEG质量分数小于12%,则双水相成相及后续探究时所需NaH2PO4的质量分数过大,导致分相后上相体积过小,不利于测量,实验结果如图3所示;分别选取图3中最佳的体系点进行综合实验比较,结果如图4所示。

图3 不同质量分数水平的PEG600/NaH2PO4双水相体系对β-葡萄糖苷酶分配系数的影响Fig.3 The effect of PEG600/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

图4 不同质量分数水平的PEG600/NaH2PO4最佳双水相体系综合比较Fig.4 The comprehensive comparison of PEG600/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with different massfraction levels on extraction of β-glucosidase

由图3可以看出,12%PEG600组成的双水相体系总体分配系数大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而当固定PEG600的质量分数后,随着NaH2PO4的质量分数的增加,分配系数逐渐下降。图4选取图3中分配系数最高的体系组合进行综合比较,PEG600对β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的双水相体系组成为12% PEG600+21% NaH2PO4。

由图3和图4可见,PEG和盐的质量分数越接近其相应的成相双节线时,下相对β-葡萄糖苷酶的萃取效果越好,即最佳体系出现在其双节线成相临界点处,而随着PEG和盐的质量分数的增大,其萃取效果逐渐下降。

2.3.2 PEG1000对萃取β-葡萄糖苷酶效果的影响 分别固定PEG1000的质量分数为10%、12%、14%、16%、18%,以体系刚好成相的NaH2PO4质量分数为起点,以1%的变化量依次递增NaH2PO4质量分数,结果如图5所示;分别选取图5中最佳的体系点进行综合实验比较,结果如图6所示。

图5 不同质量分数水平的PEG1000/NaH2PO4双水相体系对β-葡萄糖苷酶分配系数的影响Fig.5 The effect of PEG1000/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different massfraction levels on distribution coefficient of β-glucosidase

图6 不同质量分数水平PEG1000/NaH2PO4最佳双水相体系综合比较Fig.6 The comprehensive comparison of PEG1000/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with different massfraction levels on extraction of β-glucosidase

由图5可以看出,10% PEG1000组成的双水相体系总体分配系数最大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而当固定PEG1000的质量分数后,随着NaH2PO4的质量分数的增加,分配系数在第一点和第二点出现峰值,随后逐渐下降。图6选取图5中分配系数最高的体系组合进行综合比较,10% PEG1000+20% NaH2PO4的组合对β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳。

由图5可见,PEG1000的分配行为与PEG600相比略有变化,随着PEG质量分数的增加,最佳萃取体系组成略有后移,但双水相体系组成在其双节线附近时,下相对β-葡萄糖苷酶的萃取效果越好,且随着PEG和盐的质量分数的增大,其萃取效果逐渐下降。

2.3.3 PEG1500对萃取β-葡萄糖苷酶效果的影响 分别固定PEG1500的质量分数为10%、12%、14%、16%、18%,以体系刚好成相的NaH2PO4质量分数为起点,以1%的变化量依次递增NaH2PO4质量分数,结果如图7所示;分别选取图7中最佳的体系点进行综合实验比较,结果如图8所示。

图7 不同质量分数水平的PEG1500/NaH2PO4双水相体系对β-葡萄糖苷酶分配系数的影响Fig.7 The effect of PEG1500/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

图8 不同质量分数水平PEG1500/NaH2PO4最佳双水相体系综合比较Fig.8 The comprehensive comparison of PEG1500/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with differentmass fraction levels on extraction of β-glucosidase

由图7可以看出,10% PEG1500组成的双水相体系总体分配系数大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而当固定PEG1500的质量分数后,随着NaH2PO4的质量分数的增加,分配系数在第二点出现峰值,随后逐渐下降。图8选取图7中分配系数最高的体系组合进行综合比较,发现虽然分配系数上10%+18%的组成最高,但下相β-葡萄糖苷酶酶活及纯化倍数最高的是12%+17%的组成,在下相萃取率相近的情况下,PEG1500对β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的双水相体系组成为12% PEG1500+17% NaH2PO4。

由图7和图8可见,PEG1500的最佳分配行为点不再是双节线上的成相点,均发生后移,随着PEG和盐的质量分数的增大,下相对β-葡萄糖苷酶的萃取效果先增后降,且最佳点均出现在考察的第二个双水相体系构成点。

2.3.4 PEG2000对萃取β-葡萄糖苷酶效果的影响 分别固定PEG2000的质量分数为10%、12%、14%、16%、18%,以体系刚好成相的NaH2PO4质量分数为起点,以1%的变化量依次递增NaH2PO4质量分数,结果如图9所示;分别选取图9中最佳的体系点进行综合实验比较,结果如图10所示。

图9 不同质量分数水平的PEG2000/NaH2PO4双水相体系对β-葡萄糖苷酶分配系数的影响Fig.9 The effect of PEG2000/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

图10 不同质量分数水平PEG2000/NaH2PO4最佳双水相体系综合比较Fig.10 The comprehensive comparison of PEG2000/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with differentmass fraction levels on extraction of β-glucosidase

由图9可以看出,10%和12% PEG2000组成的双水相体系总体分配系数相近且均较大,即β-葡萄糖苷酶富集于下相;而当固定PEG2000的质量分数后,随着NaH2PO4的质量分数的增加,分配系数在第二点或第三点出现峰值,随后逐渐下降。图10选取图9中分配系数最高的体系组合进行综合比较,发现虽然分配系数、下相β-葡萄糖苷酶酶活、下相萃取率均最高,因此,PEG2000对β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的双水相体系组成为10% PEG2000+18% NaH2PO4。

规律总结:图9可见,PEG2000的分配系数规律发生较大改变,下相萃取效果最佳的体系组成相较于前三者有远离双节线的趋势,即PEG和盐的质量分数增加范围在1%～4%之间,萃取效果更好,但超过此范围后,萃取效果随之下降。且其分配系数较前三者迅速增大,这是由于β-葡萄糖苷酶在上相分配极少,更多富集中于下相,且两相分相处富集出现较为明显的杂质薄层。由图10可见,双水相体系的萃取效果随着PEG质量分数的增加而下降。

2.3.5 PEG4000对萃取β-葡萄糖苷酶效果的影响 分别固定PEG4000的质量分数为8%、10%、12%、14%、16%,以体系刚好成相的NaH2PO4质量分数为起点,以1%的变化量依次递增NaH2PO4质量分数,结果如图11所示;分别选取图11中最佳的体系点进行综合实验比较,结果如图12所示。

图11 不同质量分数水平的PEG4000/NaH2PO4双水相体系对β-葡萄糖苷酶分配系数的影响Fig.11 The effect of PEG4000/NaH2PO4 aqueoustwo-phase systems with different mass fractionlevels on distribution coefficient of β-glucosidase

图12 不同质量分数水平PEG4000/NaH2PO4最佳双水相体系综合比较Fig.12 The comprehensive comparison of PEG4000/NaH2PO4optimal aqueous two-phase systems with differentmass fraction levels on extraction of β-glucosidase

由图11可以看出,10%和12%PEG4000组成的双水相体系总体分配系数总体较高;而当固定PEG4000的质量分数后,随着NaH2PO4的质量分数的增加,分配系数分别在前四点都出现过峰值,随后逐渐下降。图12选取图11中分配系数最高的体系组合进行综合比较,在分配系数相近的情况下,下相β-葡萄糖苷酶酶活最高的是12%+15%的组成,因此,PEG4000对β-葡萄糖苷酶萃取效果最佳的双水相体系组成为12% PEG4000+15% NaH2PO4。

PEG4000与PEG2000有相似的规律,且由图11可见,PEG4000总体的分配系数显著提升,说明目标酶大量富集于下相且酶活较高,而上相目标酶极少。最佳双水相萃取体系组成则随着PEG质量分数的增加呈现先平稳后缓慢下降的趋势。

2.3.6 不同PEG分子量的最佳双水相体系综合比较 分别选取图4、6、8、10、12中萃取效果(下相总酶活、下相纯化倍数及萃取率)最佳的双水相体系组成—Ⅰ:12% PEG600+21% NaH2PO4;Ⅱ:10%PEG1000+20% NaH2PO4;Ⅲ:12% PEG1500+17% NaH2PO4;Ⅳ:10% PEG2000+18% NaH2PO4;Ⅴ:12% PEG4000+15% NaH2PO4。在相同的环境条件下同时进行比较,经过三次平行实验后,综合平均结果如图13所示。

图13 对β-葡萄糖苷酶有最佳萃取效果的双水相体系综合比较Fig.13 The comprehensive comparison of aqueoustwo-phase systems with optimalextraction effect on β-glucosidase

图13中,体系Ⅴ的实验结果最佳,双水相体系构成为12% PEG4000+15% NaH2PO4时对粗酶液有最佳萃取效果,实验过程是较为全面的对双水相体系组成进行系统探究,可信度较高。

表3 正交试验方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

表4 双水相最优组合比较Table 4 The comprehensive comparison of optimal aqueous two-phase systems

2.4 最佳双水相体系的正交实验结果

正交实验结果如表2所示。方差分析见表3。

表2 双水相体系β-葡萄糖苷酶正交试验结果Table 2 The result on the orthogonal test of theultrasonic assisted β-glucosidase extraction

通过表2的极差R可知,RA

通过实验结果可以看出,探究双水相最佳体系组成的正交试验存在一定的局限性,最终结果与实际结果有偏差,这是由于双水相体系成相的特殊性,影响双水相体系组成的因素水平不能简单的以单因素组合进行设计,不但需要考虑各因素水平所组成的体系实验组是否都能成相,还需考虑所选择的因素水平是否在其最优水平范围内。但若因素水平选择只考虑最优范围,则可能导致出现无法成相的实验组,反之,若只考虑是否成相来选择因素水平,则对于不同分子量的PEG来说,因素水平并未都在其最优水平范围内。若同时进行比较,便不具有代表性,无法说明结果为最优体系组成。因此,通过2.3的实验方法和结果总结出的规律,作为双水相最佳体系选择依据则更为可信。

2.5 双水相体系pH对β-葡萄糖苷酶萃取效果的影响

改变12% PEG4000+15% NaH2PO4最佳双水相体系的pH,探究pH对β-葡萄糖苷酶萃取效果的影响。由于测量需要,将总体系按比例扩大至20 g。结果如下图14所示。

图14 体系pH对β-葡萄糖苷酶萃取效果的影响Fig.14 The effect of pH value on extraction of β-glucosidasewith aqueous two-phase system

如图14所示,当双水相体系pH为3.5时,即该双水相体系未经调节的体系自然pH,下相β-葡萄糖苷酶呈现出最高酶活,萃取率最高。这可能是由于该pH在β-葡萄糖苷酶的最适pH范围内[26],而通过加入HCl或NaOH改变体系自然pH后,此时加入的HCl或NaOH使体系的构成发生改变,且分相后上、下相pH会再次发生改变,不利于β-葡萄糖苷酶的酶活力回收。

2.6 双水相体系中样品加入量对β-葡萄糖苷酶萃取效果的影响

改变12% PEG4000+15% NaH2PO4最佳双水相体系的样品(粗酶液)的加入量,探究总质量为10 g的双水相体系对样品的最大处理量。结果如图15所示。

图15 样品加入量对β-葡萄糖苷酶萃取效果的影响Fig.15 The effect of sample quantity on extraction ofβ-glucosidase with aqueous two-phase system

当样品加入量小于等于2 g时,下相酶活呈线性递增,酶比活也呈递增趋势;下相萃取率及分配系数略有下降;当粗酶加入量大于2 g之后,酶比活不再增加,下相酶活增量明显减缓,下相萃取率和分配系数快速下降,此现象说明粗酶加入量一超过了该双水相体系萃取能力的最大载荷,因此可以确定总质量为10 g的该双水相体系的最大处理量为2 g,即该双水相体系对粗酶液的最大处理量为体系总质量的20%。

2.7 超声波辅助双水相对β-葡萄糖苷酶萃取效果的影响

对双水相技术萃取过程中进行超声波处理与未进行超声波处理的萃取效果的比较,结果如下图16所示。

图16 超声波辅助双水相萃取β-葡萄糖苷酶效果的影响Fig.16 The effect of ultrasonic assisted on extraction ofβ-glucosidase with aqueous two-phase system

经过超声波处理的双水相体系总体参数水平略优于无超声处理体系,其中,C实验方法:PEG+NaH2PO4+粗酶液+水混匀后再超声,能略微提高目标酶的萃取效果。因此可以考虑在双水相萃取过程中加入超声波辅助萃取。但就经济效益和实验成本考虑,不建议增加该辅助步骤。

3 结论

实验结果表明,对鲍鱼内脏中β-葡萄糖苷酶的分离提取效果最佳、获得酶活最高、回收率最高的PEG/NaH2PO4双水相体系组成为:12% PEG4000+15% NaH2PO4;该体系pH对双水相体系萃取效果存在影响,体系自然状态下的pH即为最适pH;该双水相体系的饱和处理量为总体系的20%;双水相萃取过程中加入超声辅助能够略微提高β-葡萄糖苷酶的酶活和回收率,即PEG+NaH2PO4+粗酶液+水混匀后,超声波180 W处理5 min。

通过该实验结果发现,双水相体系萃取目标酶存在一定规律:PEG分子量越大,目标酶于下相的分配系数越大,萃取效果越好。同一PEG分子量中,随着PEG质量分数的增加,萃取效果总体上呈现逐渐下降趋势,即最佳双水相体系PEG和盐的质量分数组成可在其相图双节线附近选取。利用该规律可将类似探究双水相萃取蛋白质的最佳体系组成的实验设计及方法进行简化:若选择PEG600、PEG1000 和PEG1500时只需探究PEG和盐的质量分数在双节线上方0%～2%的实验范围内递增进行实验,即可找到最佳体系;若选择PEG2000和PEG4000,则PEG和盐的质量分数递增的实验范围在1%～4%以内,在此范围内进行比较试验即可快速且精准找到最佳体系。

上述规律的形成和机理有待进一步实验探究和解释,但在双水相萃取技术中,该规律的总结对最佳双水相体系的选择上具有一定的参考价值。该规律也为在生物分离方法中选用双水相萃取技术提供了一个较为可靠的实验基础和新的研究思路。在后续的实验探索中,将进一步探究该规律的适用范围及其机理成因,同时还将尝试探究双水相二次萃取技术的应用方法及规律。