刘 鑫,屈跃宽,曹立民,隋建新

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一种基于抗原抗体特异性结合的快速检测技术,具有高灵敏性、简便性和高通量等优点,被广泛应用于农兽药残留、环境污染物、生物毒素和食品添加剂等危害物的检测中。常规ELISA通常包括添加一抗和酶标二抗两个关键环节[1],其中辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记的二抗是ELISA中的核心物质之一。现阶段酶标二抗的制备普遍使用化学偶联的方式将抗体与酶交联,反应过程可能会产生分子的随机交联[2],导致酶活性及抗体亲和性的不同程度损失。同时,化学偶联物的分子比例难以控制,偶联过程需要昂贵的试剂,且HRP标记的抗体对温度敏感,在高温下极易变性失活,这些不足影响了其在ELISA技术中的应用[3]。

碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)可以水解去除底物上的磷酸基团,是广泛使用的免疫诊断试剂之一,但其表面糖基含量较低,通过化学偶联法获得抗体-碱性磷酸酶复合物的效率较低,价格昂贵,热稳定性较差[4],在ELISA中应用较少。研究报道发现,使用基因工程构建酶和抗体的融合蛋白可以代替化学偶联的方法进行抗体标记[5-6],且可以克服化学偶联方法的许多劣势。针对单链抗体-碱性磷酸酶(scFv-AP)融合蛋白的研究表明,碱性磷酸酶可在保持酶活性的同时提高scFv-AP融合蛋白对抗原的亲和力[7-8],在荧光免疫分析中具有更高的灵敏性[9]。近年来,虽然scFv-AP融合蛋白已用于莱克多巴胺、O,O-二乙基有机磷农药[10-11]等小分子化合物的检测,但通过基因工程技术获得具有高亲和力和高热稳定性的单链抗体[12-13]仍然可遇不可求。

单域抗体(single-domain antibody,sdAbs)是利用基因工程技术从骆驼科动物和软骨鱼血清中克隆得到的只保留重链可变区的具有抗原结合活性的新型抗体[14]。与常规抗体相比,sdAb分子量小(约15 kDa),具有更高的亲和力和热稳定性。基于这些优点,包括骆驼重链可变区(VHH)和鲨鱼重链可变区(VNAR)在内的sdAb已被广泛用于治疗、检测和生物技术等领域[15-20]。研究发现,与原始VHH相比,VHH-AP融合蛋白可增加抗体的结合亲和力,且热稳定性与原始抗体相比没有明显变化[21-23]。鲨源VNAR因其特定的结构和生长环境而具有更好的亲和力和稳定性[24-25],但受到动物养殖限制,关于VNAR的研究报道相对较少。

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)作为丝氨酸蛋白酶的一种,广泛存在于鱼类肌肉组织中,在适宜条件下可有效降解肌原纤维中的肌球蛋白重链,是导致鱼糜制品蛋白凝胶劣化、弹性下降的主要原因[26]。本实验室前期利用鲨鱼VNAR抗体进行了MBSP活性抑制的研究,该研究已通过噬菌体展示技术从鲨鱼单域抗体文本库中淘选出可识别MBSP的VNAR抗体基因,并表达出特异性识别MBSP的VNAR抗体,将其命名为B7(已申请名为“一种鲢鱼鱼糜凝胶劣化的生物抑制剂”的发明专利)。本研究以B7为目的基因,克隆表达单域抗体-碱性磷酸酶(B7-AP)融合蛋白,对融合蛋白的亲和力和热稳定性进行研究,可为单域抗体-碱性磷酸酶融合蛋白在ELISA中的应用提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

限制性核酸内切酶和T4 DNA连接酶 北京New England Biolabs公司;2xT5 Super PCR Mix和DNA凝胶纯化试剂盒 北京擎科生物技术有限公司;氨苄青霉素,SDS-PAGE凝胶试剂盒,异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)和HRP标记羊抗鼠IgG 北京索莱宝科技有限公司;EL-P-NPP显色试剂盒、引物AP-F和AP-R 上海生工生物工程股份有限公司;大肠杆菌DH5a感受态细胞,大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞和快速质粒小提试剂盒DP105 北京天根生化科技有限公司;生物素化试剂盒 江苏博美达生物科学有限公司;所有缓冲液配制所用试剂 均为国产分析纯;携带AP基因的载体pet22b-phoA 华南农业大学馈赠;鼠抗鲨鱼VNAR抗体IgG 马里兰大学医学院友情提供;兔源抗his标签的多克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG 上海生工生物工程股份有限公司;MBSP蛋白、特异性VNAR抗体(B7)和碱性磷酸酶(AP) 本实验室前期研究制备。

CMax Plus微孔板酶标仪 上海美谷分子仪器;Octet RED96e 美国加利福尼亚州ForteBio公司。

1.2 实验方法

1.2.1 重组质粒pet22b-B7-phoA的构建 通过互补限制位点将B7的C末端融合到碱性磷酸酶编码基因片段phoA的N末端构建编码B7-AP融合蛋白的重组质粒pet22b-B7-phoA。使用2xT5 Super PCR Mix,扩增B7基因(AP-F:5′-CAGAGCTCATAATAA GGAATTCCATGGCTCGAGTGGAC;AP-R:5′-AAGC TTGGCCGCATTCACAGTCAC)。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶验证后用DNA凝胶纯化试剂盒纯化,用Sac I和Hind Ⅲ限制性核酸内切酶同时酶切目的片段B7和载体pet22b-phoA后,使用T4 DNA连接酶将酶切后的B7片段连接到载体pet22b-phoA中。通过热击法(42 ℃,45 s)将重组的pet22b-B7-phoA质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,将转化的细菌接种到含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上,在37 ℃过夜培养后,挑选阳性单克隆按照快速质粒小提试剂盒DP105的使用方法提取质粒,送到上海生工生物工程股份有限公司进行DNA测序。

1.2.2 B7-AP融合蛋白的表达 以热击法将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板中37 ℃培养过夜。将培养物转移到含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液态培养基中37 ℃振荡(转速200 r/min)培养至OD600为0.4～0.6,加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L,16 ℃振荡(转速200 r/min)诱导18 h,4000×g离心20 min收集细菌细胞,用TBS缓冲液(50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl)洗涤3次后复溶菌体,在高压(6×107～7×107Pa)条件下破碎细胞。将破碎后的细胞用12000×g离心30 min后收集上清液,利用12% SDS-PAGE(按照北京索莱宝科技有限公司SDS-PAGE凝胶试剂盒的具体步骤配制)验证[27]可溶性B7-AP融合蛋白的表达效果。

1.2.3 表达条件的优化 在1.2.2的基础上,通过改变IPTG的终浓度(0～1 mmol/L,诱导温度为16 ℃)和诱导温度(16、20、30、37 ℃,IPTG终浓度为0.5 mmol/L)探究融合蛋白的最佳表达条件,并将表达后的上清液同样通过12% SDS-PAGE进行验证。

1.2.4 B7-AP融合蛋白的纯化 将表达上清液经0.45 μm无菌过滤器除菌后上样到Ni-亲和层析柱中,用十倍柱床体积的结合缓冲液(TBS缓冲液,pH8.0)洗涤后,用含不同浓度(20、50、100、200 mmol/L)咪唑的结合缓冲液洗脱,收集各洗脱组分,利用12% SDS-PAGE 验证纯化效果,使用Image J软件调节凝胶图片的灰度,对洗脱后的蛋白质条带进行灰度分析,确定纯化后融合蛋白的纯度。并利用兔源抗his标签的多克隆抗体和HRP标记的羊抗兔IgG进行Western blot(WB)鉴定,最后收集纯化的B7-AP融合蛋白,用TBS缓冲液于4 ℃过夜透析后在-20 ℃条件下存储备用。

1.2.5 B7-AP融合蛋白的鉴定

1.2.5.1 B7-AP融合蛋白的酶活测定 将B7-AP融合蛋白和AP分别稀释成系列浓度后添加到96孔板中,100 μL/孔,再向孔中添加100 μL P-NPP试剂,混匀后置于37 ℃下孵育5 min,最后加入50 μL 4 mol/L NaOH溶液终止反应,利用CMax Plus微孔板酶标仪测定405 nm处的吸光度。

1.2.5.2 B7-AP融合蛋白的抗体亲和力测定 鲨鱼VNAR抗体B7对MBSP的特异性在本实验室的前期研究中已经证实,考虑融合蛋白的表达没有改变B7的基因序列,因此在本研究中采用生物膜干涉技术(Biofilm interference,BLI)测定融合蛋白与MBSP的特异性亲和能力。具体操作为:用PBS缓冲液平衡传感器60 s后,加入生物素标记后的MBSP(浓度为5 μg/mL)进行固定,用PBST缓冲液(含0.02% Tween-20的PBS缓冲液,pH7.4)封闭180 s。在30 ℃的恒温条件下观察不同梯度下B7-AP融合蛋白及特异性VNAR抗体B7与MBSP的结合和解离情况,并通过Octet RED96e数据处理程序计算B7-AP融合蛋白和特异性VNAR抗体B7的亲和常数(KD)。

1.2.6 B7-AP融合蛋白的热稳定性分析 热处理可能会影响融合蛋白中AP的催化活性和B7的抗原结合活性,本研究将融合蛋白和单独的B7、AP在不同温度(20～85 ℃)和时间(0～180 min)下加热处理后,分别进行活性对比。

1.2.6.1 融合蛋白B7-AP和AP酶活测定 方法同1.2.5。

1.2.6.2 抗原结合能力测定 B7抗原结合能力测定方法采用常规间接ELISA方法,MBSP包被浓度为 30 μg/mL,一抗为特异性VNAR抗体B7,二抗为鼠抗鲨鱼VNAR抗体IgG,最后加入HRP标记的羊抗鼠IgG用于显色;B7-AP融合蛋白的抗原结合能力采用直接ELISA方法测定:将MBSP用CBS缓冲液稀释至30 μg/mL后添加到96孔板(100 μL/孔)中,37 ℃孵育2 h后用TBST缓冲液(含有0.05%的Tween-20,pH7.4的TBS缓冲液)洗涤3次。每孔添加300 μL含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液,在4 ℃条件下过夜封闭,并用TBST缓冲液洗涤3次。加入经过不同热处理并恢复至室温的B7-AP融合蛋白稀释液,在37 ℃孵育1.5 h后,用TBST缓冲液洗涤3次,加入100 μL稀释的P-NPP试剂并在37 ℃下孵育15 min,最后加入50 μL 4 mol/L NaOH溶液终止反应,使用CMax Plus微孔板酶标仪测定405 nm处的吸光度。

1.3 数据处理

实验中每个处理重复三次,应用Origin 8.5数据分析软件进行数据的误差分析及作图。

2 结果与讨论

2.1 B7-AP融合蛋白的表达

B7-AP融合蛋白由sdAb(14.3 kDa)和AP(47.7 kDa)两部分组成,理论分子量为62 kDa。如图1a所示,诱导温度对B7-AP融合蛋白的表达影响显著,仅在较低的诱导温度(16 ℃/20 ℃)下上清液中才出现目标条带,在30和37 ℃时上清液中并无目的蛋白的表达。这可能是由于在诱导温度较高时,转录和翻译速度过快,多肽链没有足够时间进行正确折叠,二硫键以错误形式形成,蛋白质易形成错误的空间结构,进而形成无蛋白活性的包涵体,而在较低温度时,基因的翻译速率变慢,有利于蛋白质的正确折叠,促进蛋白的可溶性表达[28-29]。IPTG浓度在0.05～1 mmol/L范围内对B7-AP融合蛋白的表达无明显影响(图1b,图1c),考虑到IPTG的存在可能会抑制细菌的生长,选择0.05 mmol/L的IPTG作为最终诱导浓度。

图1 表达条件优化的SDS-PAGE图Fig.1 SDS-PAGE gel image ofthe optimization of expression conditions注:a图表示不同温度下诱导表达的B7-AP融合蛋白;b图表示不同IPTG浓度(0～0.2 mmol/L)诱导的B7-AP融合蛋白;c图表示不同IPTG浓度(0～1 mmol/L)诱导的B7-AP融合蛋白。

用Ni-亲和层析纯化的B7-AP融合蛋白,通过SDS-PAGE和WB均发现一个约63 kDa的目的条带(图2),表明B7-AP融合蛋白表达成功。经计算,1 L发酵液可以纯化得到5 mg纯度为 90%的B7-AP融合蛋白。

图2 纯化后B7-AP融合蛋白的SDS-PAGE图和Western Blot图Fig.2 SDS-PAGE and WesternBlot gel image of purified B7-AP注:泳道M为标准蛋白;泳道1为空白对照组;泳道2为表达后的上清提取液;泳道3为纯化后的B7-AP融合蛋白;泳道4为纯化后B7-AP融合蛋白的Western Blot图。

2.2 B7-AP融合蛋白的活性

B7-AP融合蛋白应同时具有酶促活性和抗原结合活性。EL-P-NPP显色试剂盒检测表明:B7-AP融合蛋白表现出良好的显色反应,在405 nm处的吸光度随融合蛋白浓度的增加而增加,在1.25 μmol/L的浓度下吸光度达到4.00(图3)。在相同摩尔浓度下,B7-AP融合蛋白的OD405值略低于AP,这可能是因为酶的活性取决于其结合基团、催化基团及其酶活性中心的空间结构,融合蛋白的空间折叠覆盖了部分碱性磷酸酶的活性位点,并使其空间结构发生改变[30]。

图3 在相同摩尔浓度下B7-AP融合蛋白与AP的酶活性对比Fig.3 The enzyme activity of the B7-AP fusionprotein compared with AP at the same molar concentration

BLI是一种无标记的生物分析技术,通过测量亲和常数(KD,单位为mol/L),结合常数(Kon,即在1 mol/L的反应物A和B下,每秒产生的复合物数量,单位为L/(mol·s))和解离常数(Koff,即每秒解离的复合物的百分比,单位为1/s)等动力学参数,直接分析抗体对抗原的特异性识别效果。Kon表示抗原抗体形成复合物的形成速率,Kon值越大,抗原抗体结合越快;Koff反映了形成的复合物的稳定性,Koff值越大,复合物解离越快;KD则可以反映抗原与抗体相互作用的结合能力的大小,当KD值达到10-8mol/L时,表明抗原抗体之间具有很高的亲和性。结果显示(图4,表1):抗原抗体的结合程度随抗体浓度的增加而增加,融合蛋白B7-AP比B7具有更高的Kon值和更低的Koff值,表明融合蛋白更容易结合抗原并产生更稳定的缀合物。同时,B7-AP的KD(Koff/Kon)值(7.80×10-8mol/L)低于B7的KD值(1.94×10-7mol/L),表明融合蛋白的亲和力优于B7。已有研究发现,AP在溶液中可以自发产生二聚体,增强融合抗体的活性,进而增强抗体与抗原的有效结合[5,31],本实验也表明,B7-AP融合的二聚化显然有助于抗体具有更高的抗原结合力。

图4 不同浓度抗体的结合解离曲线Fig.4 The binding and dissociation curves ofantibodies at different concentrations注:a图为不同浓度B7的结合解离图;b图为不同浓度B7-AP的结合解离图。

表1 B7和B7-AP的Kon,Koff和KD值Table 1 Comparison of Kon,Koff andKD value between B7 and B7-AP

2.3 融合蛋白的热稳定性

图5 B7-AP融合蛋白的热稳定性测量结果Fig.5 The thermal stability measurement of the B7-AP fusion protein注:a图为不同温度下处理10 min后保留酶活对比结果;b图为58 ℃下处理不同时间后保留酶活对比结果;c图为不同温度下处理10 min后保留的抗原结合能力对比结果;d图为58 ℃下处理不同时间后保留的抗原结合能力对比结果。

在不同温度下处理10 min后,单独的AP活性呈现先升高后降低的趋势,在37～70 ℃温度范围内活性较高,在85 ℃加热10 min后,仍保留了80%以上的活性,表明AP二聚体的形成可能增强AP对热的抵抗力[32],而融合蛋白的AP活性在58 ℃处理10 min后即丧失了超过30%(图5a);虽然在加热10 min后融合蛋白不如单独的AP酶活高,但在58 ℃加热180 min后,单独AP的活性损失了80%以上,而融合蛋白的酶活却可以保留60%以上(图5b)。这可能是因为当融合蛋白中的两个蛋白分子相互作用时,促进了接触表面上水分子的排出,从而降低了自由能,使蛋白更加折叠并增强了融合蛋白的稳定性[33]。

在不同温度下处理10 min后,单独B7的结合活性保持良好,85 ℃加热10 min后结合活性甚至达到未加热前的三倍,这种现象的产生可能与单域抗体的特殊结构有关,短时间加热使单域抗体的结构充分伸展,快速冷却后,单域抗体进行重折叠并形成了更利于与抗原结合的结构[34]。融合蛋白的抗原结合活性呈现先增加后下降的趋势,在58 ℃时结合活性达到最大值,在85 ℃时可保留50%的活性(图5c),由于B7-AP融合蛋白在85 ℃处理10 min后仅保留20%的酶活性(图5a),因此不难推测,加热处理后B7-AP融合蛋白对MBSP的抗原结合能力是显著升高的,结果所显示的活性降低主要受融合蛋白中AP热变性的影响[23]。更重要的是,即使在58 ℃下处理180 min,B7-AP融合蛋白的整体活性仍几乎没有变化(图5d),体现出比传统酶标抗体更好的热稳定性和应用潜力。

3 结论

本研究表达并纯化出针对MBSP的单域抗体—碱性磷酸酶(B7-AP)融合蛋白,并对融合蛋白的性能和热稳定性进行了评价,为单域抗体在免疫分析中的应用提供了参考。结果表明,以0.05 mmol/L IPTG为诱导剂,在16 ℃条件下融合蛋白可以实现可溶性表达,Ni亲和纯化后蛋白纯度可以达到90%以上,产量为5 mg/L;融合蛋白对MBSP具有高亲和力,且热稳定性极佳,可以作为一种潜在的免疫诊断剂应用于ELISA的检测过程中。